304 tuubo bir ah oo aan bir lahayn oo qayb ka ah kiimikaad, Qaab dhismeedka SPACA6 ectodomain wuxuu ka kooban yahay qoys sare oo borotiinno ah oo la ilaaliyo oo la xidhiidha isku-dhafka gamete.

Waad ku mahadsan tahay booqashada Nature.com.Waxaad isticmaalaysa nooc browser ah oo leh taageero CSS xaddidan.Waayo-aragnimada ugu fiican, waxaan kugula talineynaa inaad isticmaasho browser-ka la cusboonaysiiyay (ama aad damiso Habka Laqabsiga ee Internet Explorer).Intaa waxaa dheer, si loo hubiyo taageerada joogtada ah, waxaan ku tusineynaa goobta aan lahayn qaabab iyo JavaScript.
Sliders oo muujinaya saddex maqaal sawirkiiba.Isticmaal badhamada dambe iyo kuwa xiga si aad ugu dhex gudubto boggaga, ama badhamada kantaroolaha slide ee dhamaadka si aad ugu gudubto sawir kasta.

SPACA6 waa borotiinka dusha sare ee shahwada lagu muujiyay taas oo muhiim u ah isku dhafka gamete inta lagu jiro taranka galmada naasaha.Iyadoo ay jirto doorkan aasaasiga ah, shaqada gaarka ah ee SPACA6 ayaa si liidata loo fahmay.Waxaan sharraxaynaa qaab dhismeedka kristanta ee qaybta ka-baxsan ee SPACA6 ee xallinta 2.2 Å, oo muujinaysa borotiinka laba-domain ah oo ka kooban xirmo afar-gees ah iyo Ig-sida β-sandwij oo ay ku biireen isku-xirayaasha dabacsan- dabacsan.Qaab dhismeedkani wuxuu u eg yahay IZUMO1, borotiin kale oo kuxiran gamete fusion, taasoo ka dhigaysa SPACA6 iyo IZUMO1 xubnaha aasaaska u ah qoyska sare ee borotiinnada laxidhiidha bacriminta ee halkan lagu magacaabo IST superfamily.IST superfamily waxaa qaab dhismeed lagu qeexay xidhmooyinkeeda afar-helix ee qalloocan iyo labo ka mid ah motifs CXXC ku xiran disulfide.Raadinta qaab-dhismeedka AlphaFold ee borotiinka bini'aadamka ayaa lagu aqoonsaday xubnaha borotiinka dheeraadka ah ee qoyskan sare;gaar ahaan, qaar badan oo ka mid ah borotiinadan ayaa ku lug leh isku-dhafka gamete-ka.Qaab dhismeedka SPACA6 iyo xiriirka ay la leedahay xubnaha kale ee qoyska sare ee IST ayaa bixiya xiriirka maqan ee aqoontayada fusion gamete naasleyda.
Nolol kasta oo biniaadmi ahi waxay ku bilaabataa laba xabbo oo haploid gamete ah oo kala duwan: shahwada aabbaha iyo ukunta hooyada.shahwadani waa guulaystaha hab doorasho adag oo malaayiin unug shahwo ah ay maraan xubinta taranka ee haweenka, ka gudbaan caqabadaha kala duwan1 iyo maro capacitation, taas oo kor u dhaqdhaqaaqa iyo habka qaybaha dusha sare2,3,4.Xataa haddii shahwada iyo xawada ay is helaan, howshu weli ma dhammaan.Oocyte waxaa ku wareegsan lakabka unugyada cumulus iyo xannibaad glycoprotein ah oo loo yaqaan zona pellucida, kaas oo ay tahay in shahwadu ay ka gudubto si ay u gasho oocyte.spermatozoa waxay isticmaashaa isku darka unugyo ku dheggan oogada iyo enzymes-ku-xiran xuubka iyo sirta si ay uga gudbaan caqabadahan ugu dambeeya5.Unugyadan iyo enzymes-yadan waxay inta badan ku kaydsan yihiin xuubka gudaha iyo matrixka akrosomal waxaana la ogaadaa marka xuubka sare ee shahwadu ay liibaanto inta lagu jiro falcelinta acrosomal6.Talaabada ugu danbeysa ee safarkan aadka u daran waa dhacdada isku dhafka shahwada iyo ukunta, taasoo ay labada unug isku daraan xuubkooda si ay u noqdaan hal noole diploid ah7.Inkasta oo habkani uu yahay mid soo jiidanaya taranka aadanaha, isdhexgalka molecular ee lagama maarmaanka ah ayaa si liidata loo fahmay.
Marka lagu daro bacriminta gametes-ka, kimisteriga isku-dhafka laba-bilayer ee dufanka ayaa si weyn loo darsay.Guud ahaan, isku-dhafka xuubka waa hab aan tamar lahayn oo u baahan kicinta borotiinka si uu u maro isbeddel qaabdhismeed dhismeed kaas oo isu keena laba xuub oo isku soo dhawaada, jebiya sii jiritaankooda oo keenaya fusion8,9.Kiciyayaasha borotiinka waxaa loo yaqaan fusogens waxaana laga helay hababka fiyuuska ee aan la tirin karin.Waxaa looga baahan yahay gelitaanka fayraska ee unugyada martida loo yahay (tusaale, gp160 ee HIV-1, kororka coronaviruses, hemagglutinin ee fayraska hargabka) 10,11,12 placental (syncytin) 13,14,15 iyo fiyuusyada abuurista gamete ee eukaryotes hoose ( HAP2/GCS1 ee dhirta, protists iyo arthropods) 16,17,18,19.Fusogens ee gametes-ka bini'aadamka weli lama helin, inkastoo dhowr borotiino la muujiyay in ay muhiim u yihiin isku-xirnaanta gamete-ka iyo isku-dhafka.CD9-ka oocyte-ku muujiyay, borotiinka transmembrane ee looga baahan yahay isku dhafka jiirka iyo gametes-ka aadanaha, ayaa ahaa kii ugu horreeyay ee la ogaado 21,22,23.In kasta oo shaqadeeda saxda ah ay tahay mid aan caddayn, doorka adhesion-ka, qaab-dhismeedka foci foci ee ukunta microvilli, iyo/ama meelaynta saxda ah ee borotiinnada dusha sare ee oocyte waxay u muuqataa inay u badan tahay 24,25,26.Labada borotiin ee caadiga ah ee muhiimka u ah isku-dhafka gamete waa borotiinka shahwada IZUMO127 iyo borotiinka oocyte JUNO28, iyo ururkooda wadaaga ah waa tallaabo muhiim ah oo aqoonsiga gamete iyo ku dheggan ka hor fiyuuska.Jiirka Izumo1 ee lab iyo dheddigga Juno knockout jiirarka gabi ahaanba waa madhalays, moodooyinkan shahwadu waxay galaan booska perivitelline laakiin gametes-ku ma galaan.Sidoo kale, isku-darka ayaa hoos u dhacay markii gametes lagu daaweeyay ka-hortagga-ZUMO1 ama JUNO27,29 unugyada difaaca jirka ee tijaabooyinka bacriminta ee bini'aadamka.
Dhowaan, koox cusub oo la helay oo borotiinno shahwadeed ah oo la mid ah IZUMO1 iyo JUNO20,30,31,32,33,34,35 ayaa la helay.Shahwada acrosomal xuubka borotiinka-xiriirka leh ee 6 (SPACA6) ayaa loo aqoonsaday inay muhiim u tahay bacriminta daraasad ballaaran oo mutagenesis mutagenesis ah.Gelida transgene ee hidda-wadaha Spaca6 waxay soo saartaa shahwad aan fiicneyn, inkastoo shahwadahan ay galaan booska perivitelline 36.Daraasadihii xigay ee jiirarka ayaa xaqiijiyay in Spaca6 looga baahan yahay fusion gamete 30,32.SPACA6 waxaa lagu muujiyay ku dhawaad ​​xiniinyaha waxayna leedahay qaab deegaan oo la mid ah kan IZUMO1, oo ah gudaha gudaha shahwada ka hor falcelinta acrosomal, ka dibna u guurto gobolka dhulbaraha ka dib falcelinta acrosomal 30,32.Spaca6 homologues waxay ku jiraan noocyo kala duwan oo naasley ah iyo eukaryotes kale 30 iyo muhiimada ay u leedahay isku-dhafka gamete-ka bani'aadamka ayaa lagu muujiyay xannibaadda bacriminta bini'aadamka ee vitro iyada oo la iska caabinayo SPACA6 30.Si ka duwan IZUMO1 iyo JUNO, faahfaahinta qaab dhismeedka, isdhexgalka, iyo shaqada SPACA6 weli ma cadda.
Si loo fahmo habka aasaasiga ah ee ka hooseeya isku dhafka shahwada iyo ukunta bini'aadamka, taas oo awood noo siin doonta inaan ku wargelinno horumarka mustaqbalka ee qorsheynta qoyska iyo daaweynta bacriminta, waxaan sameynay SPACA6 daraasado qaabdhismeedka iyo biochemical ah.Qaab dhismeedka kristanta ee qaybta ka baxsan unugga ee SPACA6 waxay tusinaysaa xidhmo afar-helical ah (4HB) iyo xayndaab-immunoglobulin-like (Ig-like) oo ay ku xidhan yihiin gobollo dabacsan.Sida lagu saadaaliyay daraasadihii hore, 7,32,37 qaab-dhismeedka domain ee SPACA6 wuxuu la mid yahay kan bini'aadamka IZUMO1, labada borotiinna waxay wadaagaan ujeedo aan caadi ahayn: 4HB oo leh dusha sare ee helical saddex geesood ah iyo labo ka mid ah naqshadaha CXXC ee disulfide ku xiran.Waxaan soo jeedineynaa in IZUMO1 iyo SPACA6 ay hadda qeexaan qoys weyn oo qaab dhismeed la xiriira oo borotiinno ah oo la xiriira fusion gamete.Annaga oo adeegsanayna sifooyin u gaar ah qoyska sare, waxaan samaynay baaritaan dhammaystiran oo loogu talagalay borotiinka qaab dhismeedka aadanaha ee AlphaFold, annaga oo aqoonsanay xubno dheeraad ah oo qoyskan ka sarreeya, oo ay ku jiraan xubno badan oo ku lug leh isku-dhafka gamete iyo/ama bacriminta.Hadda waxa ay u muuqataa in ay jiraan isku laab-dhismeed guud iyo qoys sare oo borotiinno ah oo la xidhiidha isku-dhafka gamete-ka, iyo qaab-dhismeedkeenu waxa uu bixiyaa khariidad kelli ah oo ka mid ah habkan muhiimka ah ee habka fiyuuska gamete-ga aadanaha.
SPACA6 waa borotiinka transmembrane-ka-dhaafka ah oo leh hal N-linked glycan iyo lix dammaanad disulfide ah (Jaantus S1a iyo S2).Waxaan ku muujinnay qaybta ka baxsan unugga ee SPACA6 (haraadiga 27-246) ee unugyada Drosophila S2 waxaanan nadiifinay borotiinka iyadoo la adeegsanayo nikkel-xiriirka, beddelka cation, iyo cabbirka ka saarida chromatography (Jaantus. S1b).SPACA6 ectodomain ee la safeeyey waa mid aad u deggan oo isku mid ah.Falanqaynta iyadoo la adeegsanayo cabbirka ka saarida chromatography oo ay weheliso kala firdhisanaanta iftiinka laba geesoodka ah (SEC-MALS) ayaa daaha ka qaaday hal ugu sarreeya oo miisaankiisu yahay 26.2 ± 0.5 kDa (Jaantus. S1c).Tani waxay la socotaa xajmiga SPACA6 monomeric ectodomain, taas oo muujinaysa in oligomerization uusan dhicin inta lagu jiro nadiifinta.Intaa waxaa dheer, spectroscopy-ga wareegga wareegga (CD) ayaa muujiyay qaab dhismeedka α / β isku dhafan oo leh barta dhalaalaysa ee 51.3 ° C (Sawir S1d, e).Deconvolution of spectra CD ayaa shaaca ka qaaday 38.6% α-helical iyo 15.8% β-stranded curiyayaasha (Jaantuska S1d).
SPACA6 ectodomain-ka waxaa lagu qurxiyey iyadoo la isticmaalayo matrix-ka random seeding38 taasoo keentay in xogta la dejiyo oo xalkeedu yahay 2.2 Å (Shaxda 1 iyo Jaantuska S3).Isticmaalka isku darka beddelka molecular-ka ku salaysan ee jajaban iyo xogta wejiga SAD oo leh soo-gaadhista bromide ee go'aaminta qaabdhismeedka (Shaxda 1 iyo Jaantuska S4), qaabka ugu dambeeya ee la safeeyey wuxuu ka kooban yahay hadhaaga 27-246.Waqtiga qaab dhismeedka la go'aamiyay, ma jirin wax tijaabo ah ama qaabdhismeedka AlphaFold oo la heli karo.SPACA6 ectodomain waxay cabbirtaa 20 Å × 20 Å × 85 Å, waxay ka kooban tahay todoba helices iyo sagaal β-strands, waxayna leedahay laalaab sare oo dheer oo lagu xasiliyay lix xidhmooyin disulfide ah (Jaantus 1a, b).Cufnaanta elektarooniga ah ee daciifka ah ee dhamaadka Asn243 silsiladda dhinaca waxay muujineysaa in hadhaagani yahay glycosylation N-ku xiran.Qaab-dhismeedku waxa uu ka kooban yahay laba qaybood: xidhmo N-terminal afar-helix ah (4HB) iyo C-terminal Ig-like domain oo leh gobol dhexda ah oo u dhexeeya (Jaantus. 1c).
Qaab dhismeedka qaybta unugyada ka baxsan ee SPACA6.Jaantuska xariijinta qaybta ka-baxsan ee SPACA6, midabka silsiladda N ilaa C-terminus laga bilaabo buluug madow ilaa casaan madow.Cysteines ku lug leh curaarta disulfide ayaa lagu muujiyay magenta.b Topology ee qaybta unugga ka baxsan ee SPACA6.Isticmaal midab isku mid ah sida sawirka 1a.c SPACA6 domain extracellular.4HB, hinge, iyo Ig-u eg jaantusyada xariijinta xayndaabka waa midab oranji, cagaar, iyo buluug, siday u kala horreeyaan.Lakabyada looma sawirin miisaan.
Qaybta 4HB ee SPACA6 waxaa ka mid ah afar helices oo waaweyn (helices 1-4), kuwaas oo loo habeeyay qaab helix helical ah (Jaantus. 2a), beddelka u dhexeeya isdhexgalka ka hortagga iyo isbarbardhigga (Jaantus. 2b).Helix yar oo dheeraad ah oo hal-rogasho ah (helix 1′) ayaa la dhigayaa si toos ah xirmada, samaynta saddex xagal leh helices 1 iyo 2. Sawirka 2a).
4HB N-terminal strip shaxanka.b Aragtida sare ee xidhmo afar helices ah, helix kasta waxa lagu iftiimiyay buluug madow ee N-terminus iyo casaan madow ee C-terminus.c jaantuska giraangiraha kor-hoos u socda ee 4HB, iyadoo hadhaaga mid walba lagu muujiyay goobaabin ay ku qoran tahay hal xaraf oo amino acid code ah;Afarta amino acid ee ugu sarreeya giraangiraha oo keliya ayaa la tiriyey.Hadhaaga aan dabaylaha ahayn waa midab huruud ah, haraaga aan dabaysha lahayn waa cagaar, haraaga si togan loo dallacay waa midab buluug, iyo haraaga si xun loo dallacay waa midab casaan ah.d Wajiyada saddex xagal ee 4HB, oo leh 4HBs liimi ah oo ku dheggan cagaar.Labada qayboodba waxay muujinayaan ul-qaabeeya curaarta disulfide.
4HB waxay ku urursan tahay xudunta hydrophobic-ka gudaha oo ka kooban inta badan haraaga alifleyda iyo udgoonka (Jaantus. 2c).Xuddunta waxa ay ka kooban tahay isku xidhka disulfide inta u dhaxaysa Cys41 iyo Cys55 kaas oo isku xidha helices 1 iyo 2 wadar ahaan saddexagalka sare ee sare (Jaantus. 2d).Laba xadhig oo dheeraad ah oo disulfide ah ayaa la sameeyay inta u dhaxaysa motif CXXC ee Helix 1′ iyo motif kale oo CXXC ah oo laga helay cidhifka β-timo-timo ee gobolka hinge (Jaantus. 2d).Haraaga arginine muxaafidka ah oo aan la garanaynin (Arg37) wuxuu ku yaalaa gudaha saddex xagal godan oo ay sameeyeen helices 1′, 1, iyo 2. Atomamka carbon Aliphatic Cβ, Cγ, iyo Cδ Arg37 waxay la falgalaan xudunta hydrophobic, iyo kooxaheeda guanidine waxay si meerto ah u dhaqaaqaan. inta u dhaxaysa helices 1′ iyo 1 iyada oo la adeegsanayo isdhexgalka u dhexeeya Thr32 laf dhabarta iyo silsiladda dhinaca (Jaantus. S5a,b).Tyr34 waxay ku fidsan tahay godka godka iyadoo ka tagaysa laba dalool oo yaryar kuwaas oo Arg37 uu la falgali karo dareeraha.
Ig-like β-sandwich domains waa qoys weyn oo borotiinno ah oo wadaaga sifada guud ee laba ama in ka badan oo amphipathic β-sheet ah oo isku xiran oo dhexmara xudunta hydrophobic 39. Qaybta C-terminal Ig-sida ee SPACA6 waxay leedahay qaab isku mid ah waxayna ka kooban tahay laba lakab (Sawir S6a).Sheet 1 waa β-sheet oo ka kooban afar xadhig ( strands D, F, H, iyo I) halkaas oo xargaha F, H, oo aan sameeyo habayn ka-hortagga isbarbar-dhigga, iyo xargaha I iyo D waxay qaataan is-dhexgalka barbar socda.Jadwalka 2 waa xaashi beta laba-geesood ah oo yar oo ka-hortagga isbarbar-dhigga (strands E iyo G).Isku xidhka disulfide gudaha ayaa lagu arkay inta u dhaxaysa C-terminus ee silsiladda E iyo xarunta silsiladda H (Cys170-Cys226) (Sawir S6b).Isku-xidhkan disulfide-ku waxa uu la mid yahay curaarta disulfide ee qaybta β-sandwich ee immunoglobulin40,41.
Xaashiyaha β-xadhka ee afar-geesoodka ah ayaa isku rogaya dhererkiisa oo dhan, samaynta geeso asymmetrical ah oo ku kala duwan qaabka iyo electrostatics.Cidhifka dhuuban waa dusha deegaanka hydrophobic fidsan taas oo ka soo baxaysa marka la barbar dhigo meelaha aan sinnayn iyo korantada kala duwan ee SPACA6 (Jaantus. S6b,c).Halo ka mid ah kooxaha kaarboonyl/amino ee laf dhabarta iyo silsiladaha dhinaca dacalka ah ayaa ku wareegsan dusha sare ee hydrophobic (Jaantus. S6c).Margin ballaaran waxaa daboolay qayb helical daboolan oo xannibaysa qaybta N-terminal ee xudunta hydrophobic waxayna samaysaa saddex bonds hydrogen oo leh kooxda dabaysha furan ee silsiladda F ee laf dhabarta (Jaantus. S6d).Qaybta C-terminal ee cidhifkani waxa ay samaysaa jeeb weyn oo leh xudunta hydrophobic qayb ahaan.Jeebka waxaa ku hareeraysan kharashyo togan oo ay ugu wacan tahay saddex qaybood oo ah hadhaaga arginine ee labanlaaban (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 iyo Arg212-Arg214) iyo histidine dhexe (His220) (Jaantuska S6e).
Gobolka hinge waa qayb gaaban oo u dhaxaysa qaybta helical iyo Ig-like domain, oo ka kooban hal saddex geesood ah oo β-lakab ah (strands A, B iyo C), helix yar oo 310 ah, iyo dhawr qaybood oo helical random dheer.(Jaantus. S7).Shabakad isku xidhan iyo xidhiidhada korantada ee gobolka hinge waxay u muuqataa inay dejinayso hanuuninta u dhaxaysa 4HB iyo domainka Ig-sida.Shabakadda waxa loo qaybin karaa saddex qaybood.Qaybta hore waxaa ku jira laba motifs CXXC (27CXXC30 iyo 139CXXC142) kuwaas oo sameeya isku xidhid disulfide ah oo u dhexeeya β-timo-xiran ee xiniinyaha iyo 1′ helix ee 4HB.Qaybta labaad waxaa ka mid ah isdhexgalka elektrostatic ee u dhexeeya domain-ka Ig-sida iyo hinge.Glu132 ee hinge-ga waxay samaysaa buundo milix leh oo leh Arg233 oo ku taal aagga Ig-like iyo Arg135 ee hinge.Qaybta saddexaad waxa ka mid ah xidhidh isku xidhan oo ka dhexeeya domain-ka Ig-like iyo gobolka hinge.Laba dammaanad disulfide ah (Cys124-Cys147 iyo Cys128-Cys153) waxay ku xiraan wareegga hinge ilaa xiriiriyaha kaas oo dejinaya isdhexgalka korantada ee u dhexeeya Gln131 iyo kooxda laf dhabarta, taas oo u oggolaanaysa marin u helka ugu horreeya Ig-like domain.Silsilad.
Qaab dhismeedka SPACA6 ectodomain iyo qaab-dhismeedka shakhsi ahaaneed ee 4HB iyo Ig-like domains ayaa loo isticmaalay in lagu raadiyo diiwaannada qaabaysan ee la midka ah ee kaydka borotiinka 42.Waxaan aqoonsannay kulanno leh buundooyinka Dali Z sare, weecsanaanta heerka yar, iyo buundooyinka LALI ee waaweyn (kan dambe waa tirada haraaga qaabdhismeed ahaan u dhigma).Iyadoo 10-kii ugu horreeyay ee ka soo baxay raadinta ecodomain buuxa (Shaxda S1) ay lahayd Z-dhibcaha la aqbali karo ee> 842, raadinta 4HB ama Ig-like domain keligiis ayaa muujisay in badi hits-ku ay u dhigmaan β-sandwijka oo keliya.laalaab meel kasta ah oo laga helo borotiinno badan.Dhammaan saddexdii goobood ee Dali waxay soo celiyeen hal natiijo oo keliya: IZUMO1.
Muddo dheer ayaa la soo jeediyay in SPACA6 iyo IZUMO1 ay wadaagaan isku mid ahaanshiyaha qaabdhismeedka7,32,37.In kasta oo ectodomains-ka labadan borotiinada isku-dhafka ah ee gamete-ku-xiran ay wadaagaan 21% aqoonsiga taxanaha ah (Jaantuska S8a), caddayn adag, oo ay ku jiraan qaabka dammaanadda disulfide ee la ilaaliyo iyo qiyaasta C-terminal Ig-like ee SPACA6, ayaa oggolaaday isku dayo hore oo lagu dhisayo Qaabka isku midka ah ee jiirka SPACA6 iyadoo la isticmaalayo IZUMO1 qaab template37.Qaab dhismeedkayagu wuxuu xaqiijinayaa saadaashan wuxuuna muujinayaa heerka dhabta ah ee isku ekaanshaha.Dhab ahaantii, qaababka SPACA6 iyo IZUMO137,43,44 waxay wadaagaan qaab-dhismeedka laba-domain (Sawir S8b) oo la mid ah 4HB iyo Ig-like β-sandwich oo ku xiran gobolka hinge (Sawir S8c).
IZUMO1 iyo SPACA6 4HB waxay leeyihiin farqi caadi ah oo ka duwan xirmooyinka wareegyada caadiga ah.4HB-yada caadiga ah, sida kuwa laga helo isku-dhafka borotiinka ee SNARE ee ku lug leh isku-dhafka endosomal 45,46, waxay leeyihiin helisyo siman oo siman oo ilaalinaya qalooc joogto ah oo ku wareegsan dhidibka dhexe ee 47. Taas bedelkeeda, qaybaha helical ee IZUMO1 iyo SPACA6 labadaba way qalloocan yihiin, oo leh curvature isbedbeddelaya iyo baakad aan sinnayn (Jaantuska S8d).Maroojinka, oo ay u badan tahay inuu sababay saddex-xagalka ay sameeyeen helisyada 1′, 1 iyo 2, ayaa lagu hayaa IZUMO1 iyo SPACA6 waxaana lagu xasiliyey isla CXXC motif ee helix 1′.Si kastaba ha noqotee, dammaanadda dheeraadka ah ee disulfide ee laga helay SPACA6 (Cys41 iyo Cys55 si wadajir ah isku xira helices 1 iyo 2 ee kor ku xusan) waxay abuurtaa cirifka fiiqan ee xagalka saddex-xagalka, taasoo ka dhigaysa SPACA6 ka sii maroojin badan IZUMO1, oo leh saddex xagal dalool oo aad u cad.Intaa waxaa dheer, IZUMO1 waxaa ka maqan Arg37 lagu arkay bartamaha godkan ee SPACA6.Taas bedelkeeda, IZUMO1 waxay leedahay xudunta hydrophobic ee caadiga ah ee haraaga alifleyda iyo udgoonka.
IZUMO1 waxay leedahay xayndaab Ig u eg oo ka kooban laba-xadhigle iyo shan-xadhig β-sheet43.Xadhiga dheeriga ah ee IZUMO1 wuxuu bedelayaa gariiradda gudaha SPACA6, kaas oo la falgala xadhigga F si loo xaddido curaarta hydrogen ee laf dhabarta ee xadhigga.Qodob xiiso leh oo isbarbardhigga ah ayaa ah kharashka dusha la saadaaliyay ee xayndaabyada Ig-sida ee labada borotiin.Dusha sare ee IZUMO1 ayaa si xun looga dallacay dusha SPACA6.Lacag dheeraad ah ayaa ku taal meel u dhow C-terminus oo u jeedda xuubka shahwada.SPACA6, isla goboladu waxay ahaayeen kuwo dhexdhexaad ah ama si togan loo dacwooday (Jaantus. S8e).Tusaale ahaan, dusha sare ee hydrophobic (cidhifyada khafiifka ah) iyo godad si fiican loo dallacay (cidhifyada ballaaran) ee SPACA6 ayaa si xun loogu dallacay IZUMO1.
Inkasta oo xidhiidhka iyo qaybaha qaabdhismeedka sare ee u dhexeeya IZUMO1 iyo SPACA6 si fiican loo ilaaliyo, isku-habaynta qaab-dhismeedka Ig-la midka ah waxay muujisay in labada qaybood ay ku kala duwan yihiin jihada guud ee midba midka kale (Jaantus. S9).Xirmada wareega ee IZUMO1 waxay ku qalloocan tahay β-sandwich, abuurista qaabkii hore ee "boomerang" ee lagu sharraxay oo ku saabsan 50 ° laga soo bilaabo dhidibka dhexe.Taas bedelkeeda, iftiinka helicalka ee SPACA6 wuxuu u leexday qiyaastii 10 ° jihada ka soo horjeeda.Kala duwanaanshaha jihooyinkan waxay u badan tahay inay sabab u tahay kala duwanaanshaha gobolka hinge.Heerka isku xigxiga aasaasiga ah, IZUMO1 iyo SPACA6 waxay wadaagaan isku xigxig yar oo isku xigxig ah oo isku xiga, marka laga reebo cysteine, glycine, iyo hadhaaga aspartic acid.Natiijo ahaan, curaarta hydrogen iyo shabakadaha korantada ayaa gabi ahaanba kala duwan.Qaybaha qaab-dhismeedka sare ee β-sheet waxaa wadaaga IZUMO1 iyo SPACA6, inkastoo silsiladaha IZUMO1 ay aad u dheer yihiin oo 310 helix (helix 5) ay gaar u tahay SPACA6.Kala duwanaanshahan ayaa keenaya jihaynta domain kala duwan ee laba borotiino haddii kale la mid ah.
Raadintayada server-ka Dali ayaa shaaca ka qaaday in SPACA6 iyo IZUMO1 ay yihiin labada qaab ee tijaabada ah ee la go'aamiyay ee lagu kaydiyay kaydka borotiinka kuwaas oo leh 4HB laalaab gaar ah (Shaxda S1).Dhawaan, DeepMind (Alifbeetada/Google) waxay soo saartay AlphaFold, nidaam ku salaysan neural network kaas oo si sax ah u saadaalin kara qaab dhismeedka 3D ee borotiinnada taxanaha hoose48.Wax yar ka dib markii aan xalinay qaab dhismeedka SPACA6, xogta AlphaFold waa la sii daayay, iyada oo bixisa moodooyin qaab dhismeedka saadaasha ah oo daboolaya 98.5% dhammaan borotiinada ku jira proteome-ka aadanaha48,49.Isticmaalka qaabdhismeedkayaga SPACA6 ee la xaliyay qaab goobis ahaan, raadinta qaabdhismeedka qaabdhismeedka ee qaabka AlphaFold proteome aadanaha ayaa lagu aqoonsaday musharaxiinta la mid ah qaabdhismeedka suurtagalka ah ee SPACA6 iyo IZUMO1.Marka la eego saxnaanta cajiibka ah ee AlphaFold ee saadaasha SPACA6 (Sawir S10a) - gaar ahaan 1.1 Årm ectodomain marka la barbar dhigo qaab dhismeedkayaga la xaliyay (Jaantus. S10b) -waxaan ku kalsoonaan karnaa in ciyaaraha SPACA6 ee la aqoonsaday ay u badan tahay inay sax yihiin.
Markii hore, PSI-BLAST waxay raadisay kutlada IZUMO1 oo leh saddex borotiinno kale oo shahwo la xiriira: IZUMO2, IZUMO3, iyo IZUMO450.AlphaFold wuxuu saadaaliyay in borotiinada qoyska IZUMO ay isku laabaan xayndaabka 4HB oo wata qaab isku mid ah dammaanad disulfide ah sida IZUMO1 (Jaantus 3a iyo S11), in kasta oo ay ka maqan yihiin Ig-u eg.Waxaa la qiyaasayaa in IZUMO2 iyo IZUMO3 ay yihiin borotiinno xuub dhinac ah oo la mid ah IZUMO1, halka IZUMO4 ay u muuqato mid qarsoon.Hawlaha IZUMO 2, 3, iyo 4 borotiinada ku jira isku-dhafka gamete lama go'aamin.IZUMO3 waxa la og yahay in ay door ka ciyaarto biogenesis acrosome inta lagu guda jiro horumarinta shahwada51 iyo borotiinka IZUMO ayaa la ogaaday in uu sameeyo kakan50.Ilaalinta borotiinada IZUMO ee naasleyda, xamaaratada, iyo amphibians waxay soo jeedinaysaa in shaqadooda suurtogalka ah ay la jaan qaadayaan borotiinnada kale ee la yaqaan ee gamete-fusion-proteins, sida DCST1/2, SOF1, iyo FIMP.
Jaantuska qaab dhismeedka domainka qoyska sare ee IST, oo leh 4HB, hinge, iyo xayndaabyo Ig u eg oo lagu muujiyay orange, cagaar, iyo buluug, siday u kala horreeyaan.IZUMO4 waxay leedahay gobol C-terminal gaar ah oo u eg madow.Xirmooyinka disulfide-ka ee la xaqiijiyay waxaa lagu muujiyay xariiqyo adag iyo dhibco leh, siday u kala horreeyaan.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-Fold): AF-Q1ZYL8-Fold DB: AF-Q1ZYL8-F1)TMEM95, IZUMO2 iyo IZUMO3 helices transmembrane lama tusin.
Si ka duwan borotiinka IZUMO, borotiinnada kale ee SPACA (ie, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, iyo SPACA9) ayaa loo malaynayaa inay qaab ahaan ka duwan yihiin SPACA6 (Sawir S12).Kaliya SPACA9 ayaa leh 4HB, laakiin lama filayo inay yeelato isla barbar-socod ka-hortagga isbarbar-dhigga ama curaarta disulfide la mid ah sida SPACA6.Kaliya SPACA1 ayaa leh xayndaab Ig la mid ah.AlphaFold wuxuu saadaaliyay in SPACA3, SPACA4 iyo SPACA5 ay leeyihiin qaab dhismeed ka duwan kan SPACA6.Waxa xiiso leh, SPACA4 ayaa sidoo kale loo yaqaanaa inay door ka qaadato bacriminta, laakiin si ka weyn SPACA6, taas beddelkeeda fududaynta isdhexgalka u dhexeeya shahwada iyo oocyte zona pellucida52.
Raadintayada AlphaFold waxay heshay ciyaar kale oo loogu talagalay IZUMO1 iyo SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, oo ah borotiinka transmembrane ee shahwada gaar ah, wuxuu ka dhigayaa jiirarka labka ah madhalays marka laga saaro 32,33.Spermatozoa oo ka maqan TMEM95 waxay lahayd qaab-dhismeed caadi ah, dhaqdhaqaaq, iyo awood ay ku gasho zona pellucida oo ay ku xidho xuubka ukunta, laakiin kuma dami karin xuubka oocyte.Daraasadihii hore waxay muujiyeen in TMEM95 ay la wadaagto qaabdhismeedka qaabdhismeedka IZUMO133.Runtii, qaabka AlphaFold wuxuu xaqiijiyay in TMEM95 uu yahay 4HB oo leh isla lammaane CXXC motifs sida IZUMO1 iyo SPACA6 iyo isku xidhka dheeriga ah ee disulfide ee u dhexeeya helices 1 iyo 2 laga helay SPACA6 (Sawir 3a iyo S11).Inkasta oo TMEM95 ay ka maqan tahay Ig-la mid ah, waxay leedahay gobol leh qaab dammaanad disulfide ah oo la mid ah SPACA6 iyo IZUMO1 gobollada hinge (Jaantus. 3b).Waqtiga daabacaadda qoraal-gacmeedkan, server-ka preprint ayaa ka warbixiyay qaab dhismeedka TMEM95, isagoo xaqiijinaya natiijada AlphaFold53.TMEM95 waxay aad ugu egtahay SPACA6 iyo IZUMO1 waxaana si horumarsan loogu xafiday amfibiyaanka (Jaantus. 4 iyo S13).
Raadinta PSI-BLAST waxay adeegsatay NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, iyo SOF1 xogta xogta si loo go'aamiyo booska taxanahan ee geedka nolosha.Masaafada u dhaxaysa dhibcaha laanta looma tusin miisaan.
Isku ekaanshaha qaabdhismeedka guud ee u dhexeeya SPACA6 iyo IZUMO1 waxay soo jeedinaysaa inay aasaaseen xubno ka tirsan qoys sare oo qaab dhismeedka la ilaaliyo oo ay ku jiraan TMEM95 iyo IZUMO 2, 3, iyo 4 borotiinada.xubnaha la yaqaan: IZUMO1, SPACA6 iyo TMEM95.Sababtoo ah dhawr xubnood oo kaliya ayaa leh xayndaabyo Ig-u eg, astaanta IST-ga weyn ee qoyska waa domainka 4HB, kaas oo leh astaamo u gaar ah oo ay wadaagaan dhammaan borotiinadan: 1) 4HB oo la isku duubay . sida redox sensor 54,55,56, halka motif ee xubnaha qoyska IST lala xiriirin karo borotiinka disulfide isomerases sida ERp57 ee fusion gamete. Doorarka waxay la xiriiraan 57,58.
Xubnaha IST superfamily waxaa lagu qeexay saddex astaamood oo sifo ah oo ka mid ah domainka 4HB: afar helices oo u dhexeeya isbarbardhigga iyo jihaynta lidka ku ah, wejiyada xidhmada saddex-xagal ee helical, iyo ca CXXC laba motif oo ka dhex abuurmay unugyo yaryar.) N-terminal helixes (orange) iyo gobolka hinge β-timo (cagaaran).
Marka la eego isku ekaanshaha u dhexeeya SPACA6 iyo IZUMO1, awoodda kii hore inuu ku xidho IZUMO1 ama JUNO waa la tijaabiyay.Biolayer interferometry (BLI) waa hab ku xidhan kinetic-ku salaysan oo hore loo isticmaalay si loo qiyaaso isdhexgalka IZUMO1 iyo JUNO.Ka dib markii la isku dhejiyay dareeraha biotin-ku calaamadeeyay IZUMO1 oo ah sed leh xoojinta sare ee falanqaynta JUNO, calaamad xooggan ayaa la ogaaday (Sawir S14a), taas oo muujinaysa isbeddel ku-xidhan oo isbeddel ah oo ku yimaada dhumucda biomaterial-ka ee ku xiran caarada dareenka.Calaamado la mid ah (tusaale, JUNO oo ay ku lammaan tahay dareemaha sida dabin ka dhan ah IZUMO1 analyte) (Jaantus. S14b).Wax calaamad ah lama helin markii SPACA6 loo adeegsaday falanqeeye ka soo horjeeda IZUMO1 dareemaha ku xidhan ama JUNO (Jaantuska S14a,b).Maqnaanshaha calaamaddan waxay muujinaysaa in qaybta ka baxsan unugga ee SPACA6 aysan la falgelin qaybta ka-baxsan ee IZUMO1 ama JUNO.
Sababtoo ah baaritaanka BLI wuxuu ku salaysan yahay biotinylation ee hadhaaga lysine ee bilaashka ah ee borotiinka sed, wax ka beddelkaani wuxuu ka hortagi karaa in la isku xiro haddii haraaga lysine ay ku lug leeyihiin isdhexgalka.Intaa waxaa dheer, jiheynta xiritaanka ee ku xiran dareenka dareemayaasha waxay abuuri kartaa caqabado adag, sidaas darteed baaritaannada caadiga ah ee hoos u dhaca ayaa sidoo kale lagu sameeyay SPACA6, IZUMO1 iyo JUNO ectodomains.Iyadoo ay taasi jirto, SPACA6 kuma aysan dhicin isaga oo ku calaamadsan IZUMO1 ama JUNO (Sawir S14c, d), taas oo muujinaysa wax isdhexgalka ah oo la mid ah kuwa lagu arkay tijaabooyinka BLI.Sida xakamaynta togan, waxaan xaqiijinay isdhexgalka JUNO oo lagu calaamadiyay IZUMO1 (Jaantusyada S14e iyo S15).
Inkasta oo ay isku ekaanshaha qaabdhismeedka u dhexeeya SPACA6 iyo IZUMO1, awood la'aanta SPACA6 inay xidho JUNO maaha wax la yaab leh.Dusha sare ee bini'aadamka IZUMO1 waxay leedahay in ka badan 20 hadhaa ah oo la falgala JUNO, oo ay ku jiraan hadhaaga mid kasta oo ka mid ah saddexda gobol (inkasta oo intooda badan ay ku yaalliin gobolka hinge) (Jaantus. S14f).Hadhaagaan, hal kaliya ayaa lagu keydiyay SPACA6 (Glu70).Halka beddelaadyo badan oo haraaga ah ay haysteen hantidoodii bayoloji ee asalka ahayd, hadhaaga Arg160 ee muhiimka ah ee IZUMO1 waxaa lagu beddelay Asp148 ee SPACA6;Daraasadihii hore ayaa muujiyay in isbeddelka Arg160Glu ee IZUMO1 uu ku dhawaad ​​​​dhammaantii baabi'iyay ku xidhnaanta JUNO43.Intaa waxaa dheer, farqiga u dhexeeya jiheynta domain ee u dhexeeya IZUMO1 iyo SPACA6 waxay si weyn u kordhisay aagga dusha sare ee goobta JUNO-ku-xirnaanta ee gobolka u dhigma ee SPACA6 (Sawir S14g).
Inkasta oo baahida loo qabo SPACA6 ee isku-dhafka gamete-ka iyo la mid ahaanshaha IZUMO1, SPACA6 uma muuqato mid u dhiganta shaqada xiritaanka JUNO.Sidaa darteed, waxaan raadinay inaan isku geyno xogtayada qaabdhismeedka iyo caddaynta muhiimada ay bixiso bayoolaji korriinka.Isku dhafka isku xigxiga ee SPACA6 homologues waxay tusinaysaa ilaalinta qaabka guud ee ka baxsan naasleyda.Tusaale ahaan, haraaga cysteine-ka ayaa ku jira xitaa amphibians fog oo xiriir la leh (Jaantus 6a).Isticmaalka server-ka ConSurf, xogta haynta isku xigxiga ee isku xigxiga ee taxanaha 66 ayaa lagu sawiray dusha SPACA6.Falanqaynta noocan ahi waxay tusi kartaa hadhaagii la xafiday intii lagu jiray koboca borotiinka waxayna tilmaami kartaa gobollada dusha sare ee doorka ka ciyaara shaqada.
Isku dhafka SPACA6 ectodomains ee 12 nooc oo kala duwan oo la diyaariyey iyadoo la adeegsanayo CLUSTAL OMEGA.Marka loo eego falanqaynta ConSurf, boosaska ugu muxaafidka ah waxaa lagu calaamadeeyay buluug.Haraaga Cysteine ​​​​waxaa lagu muujiyay casaan.Xudduudaha domainka iyo walxaha qaabdhismeedka sare ayaa lagu muujiyey xagga sare ee toosinta, halkaas oo fallaadho ay tilmaamayaan β-strands iyo hirarka oo tilmaamaya helices.Aqoonsayaasha Helitaanka NCBI ee ka kooban taxanaha waa: aadanaha (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), daanyeer capuchin (Cebus mimic, XP_017359366), faras (Equus01 cabuscalus) 23 XP_032_034).), ido (Ovis aries, XP_014955560), maroodi (Loxodonta africana, XP_010585293), eyga ( Canis lupus familyis, XP_025277208), mouse (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil , 8) , 61_89 iyo Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Lambarayntu waxay ku salaysan tahay nidaamka aadanaha.b Matalaadda dusha sare ee qaab dhismeedka SPACA6 oo leh 4HB xagga sare iyo Ig-u eg xagga hoose, midabada ku salaysan qiyaasaha ilaalinta ee serverka ConSurf.Qaybaha ugu wanaagsan ee la ilaaliyo ayaa ah buluug, qaybaha dhexdhexaadka ah ee la ilaaliyo waa caddaan, kuwa ugu yarna waa huruud.cysteine ​​guduudan.Sadex balastar oo dusha sare ah oo muujinaya ilaalin heer sare ah ayaa lagu muujiyay galka calaamadeysan ee balastar 1, 2 iyo 3. Kartoon 4HB ayaa lagu muujiyay gudaha midigta sare (qaab midab isku mid ah).
Qaab dhismeedka SPACA6 waxa uu leeyahay saddex gobol oo sare oo aad loo ilaaliyo (Jaantus. 6b).Patch 1 wuxuu balaadhiyaa 4HB iyo gobolka hinge wuxuuna ka kooban yahay laba buundooyinka CXXC disulfide ee la xafiday, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 shabkada hinge (Jaantus. S7), iyo saddex hadhaaga caraf udgoon ee la xafiday (Phe31, Tyr73, Phe137).gees ballaadhan oo ka mid ah qaybta Ig-sida (Jaantus. S6e), taas oo ka dhigan dhowr hadhaaga si togan loo dallacay oogada shahwada.Waxa xiisaha lihi leh, balastarkani waxa uu ka kooban yahay xuubka unugyada difaaca jirka kaas oo hore loo muujiyay inuu faragelinayo shaqada SPACA6 30.Gobolka 3 wuxuu ku fidsan yahay cirifka iyo hal dhinac ee aagga Ig-sida;gobolkani waxa uu ka kooban yahay prolines la xafiday (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) iyo haraaga dabaylaha ee soo jeeda.Waxaa la yaab leh, inta badan haraaga dusha sare ee 4HB waa kuwo aad u kala duwan (Jaantus. 6b), inkasta oo laalaabku lagu keydiyo dhammaan SPACA6 homologue (sida lagu muujiyey ilaalinta xudunta xirmooyinka hydrophobic) iyo ka baxsan qoyska IST.
Inkasta oo kani yahay gobolka ugu yar ee SPACA6 oo leh qaybaha ugu yar ee la ogaan karo ee qaab-dhismeedka sare, hadhaagii gobollo badan oo haraaga ah (oo ay ku jiraan gobolka 3) ayaa aad loogu ilaaliyaa SPACA6 homologues, taas oo muujin karta in jihada xirmada helical iyo β-sandwich ay door ka ciyaaraan.muxaafid ahaan.Si kastaba ha ahaatee, inkasta oo isku-xidhka hydrogen-ka ballaaran iyo shabakadaha korantada ee gobolka hinge ee SPACA6 iyo IZUMO1, caddaynta dabacsanaanta gudaha ayaa lagu arki karaa isku-dhafka qaababka badan ee la oggol yahay ee IZUMO137,43,44.Isku toosinta xayndaabyada shakhsiga ah ayaa si fiican isku dulsaaray, laakiin jihaynta xayndaabyada marka loo eego midba midka kale wuxuu ku kala duwanaa 50 ° ilaa 70 ° dhidibka dhexe (Jaantus. S16).Si loo fahmo dhaqdhaqaaqa isbedbeddelka ah ee SPACA6 ee xalka, tijaabooyinka SAXS ayaa la sameeyay (Sawir S17a,b).Dib u dhiska dib u dhiska SPACA6 ectodomain wuxuu u hoggaansamay qaab-dhismeedka crystal-ka (Jaantus. S18), inkastoo goobta Kratky ay muujisay xoogaa dabacsanaan ah (Jaantus. S17b).Iswaafajintani waxay ka soo horjeedaa IZUMO1, kaas oo borotiinka aan xidhnayn uu u qaadanayo qaabka boomerang labadaba gudaha shabagga iyo xalka43.
Si gaar ah loo aqoonsado gobolka dabacsan, hydrogen-deuterium exchange mass spectroscopy (H-DXMS) ayaa lagu sameeyay SPACA6 waxaana la barbardhigay xogta hore loo helay IZUMO143 (Jaantus. 7a,b).SPACA6 waxay si cad uga dabacsan tahay IZUMO1, sida lagu caddeeyey isweydaarsiga sare ee deuterium inta lagu jiro qaabdhismeedka ka dib 100,000 s ee sarrifka.Labada qaab-dhismeedba, qaybta C-terminal ee gobolka hinge waxay muujinaysaa isweydaarsi heer sare ah, kaas oo laga yaabo inuu ogolaado wareegyo xaddidan ee 4HB iyo Ig-like domains marka loo eego midba midka kale.Waxa xiiso leh, qaybta C-terminal ee SPACA6 hinge, oo ka kooban haraaga 147CDLPLDCP154, waa gobol aad loo ilaaliyo 3 (Jaantus. 6b), oo ay suurtogal tahay in ay muujiso in dabacsanaanta interdomain ay tahay sifo horumarsan oo la ilaaliyo ee SPACA6.Marka loo eego falanqaynta dabacsanaanta, xogta dhalaalka kuleylka CD-ga ayaa muujisay in SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) ay ka xasilloon tahay IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (Sawir S1e iyo S19).
sawirada H-DXMS ee SPACA6 iyo b IZUMO1.Boqolkiiba beddelka deuterium waxaa lagu go'aamiyay dhibcaha wakhtiga la tilmaamay.Heerarka isweydaarsiga hydrogen-deuterium waxaa lagu muujiyaa midab miisaan miisaan laga bilaabo buluug (10%) ilaa casaan (90%).Sanduuqyada madow waxay u taagan yihiin aagagga sarrifka sare.Xuduudaha 4HB, hinge iyo Ig-u eg ee lagu arkay qaab dhismeedka crystal ayaa lagu muujiyay korka isku xigxiga aasaasiga ah.Heerarka sarrifka Deuterium ee 10 s, 1000 s, iyo 100,000 s ayaa lagu sawiray jaantuska xariijinta dusha sare ee sagxadaha molecular ee hufan ee SPACA6 iyo IZUMO1.Qaybaha qaab dhismeedka leh heerka sarrifka deuterium ee ka hooseeya 50% waa midab cad.Meelaha ka sarreeya 50% H-DXMS beddelashada waxay ku midabaysan yihiin cabbir gradient.
Isticmaalka CRISPR/Cas9 iyo hiddo-wadaha jiirka jiirka xeeladaha hidda-socodka ayaa horseeday in la ogaado dhowr arrimood oo muhiim u ah isku-xidhka shahwada iyo ukunta iyo isku-dhafka.Marka laga reebo is dhexgalka si fiican loo sifeeyay ee IZUMO1-JUNO iyo qaab dhismeedka CD9, badi borotiinada la xidhiidha isku-dhafka gamete-ka ayaa ah kuwo qaab dhismeed ahaan iyo hawl ahaanba ah.Tilmaamaha baayofisika iyo qaabdhismeedka ee SPACA6 waa qayb kale oo ka mid ah xujooyinka molecular adhesion/fusion inta lagu jiro bacriminta.
SPACA6 iyo xubnaha kale ee qoyska sare ee IST waxay u muuqdaan kuwo si aad ah loo ilaaliyo naasleyda iyo sidoo kale shimbiraha shakhsi ahaaneed, xamaaratada, iyo amphibians;Dhab ahaantii, waxaa loo maleynayaa in SPACA6 xitaa looga baahan yahay bacriminta zebrafish 59. Qaybintani waxay la mid tahay borotiinnada kale ee la xidhiidha isku-dhafka gamete-ga sida DCST134, DCST234, FIMP31, iyo SOF132, taas oo soo jeedinaysa in arrimahan ay yihiin HAP2-deficient (sidoo kale). loo yaqaan GCS1) borotiinno mas'uul ka ah dhaqdhaqaaqa kicinta ee protists badan., dhirta, iyo arthropods.Borotiinnada fiyuuska la bacrimiyey 60, 61. Inkasta oo ay isku mid yihiin qaabdhismeed xooggan oo u dhexeeya SPACA6 iyo IZUMO1, garaacista hidde-sideyaasha mid ka mid ah borotiinadan ayaa keentay dhalmo la'aan jiirarka labka ah, taas oo muujinaysa in hawlahooda isku-dhafka ah ee gamete aan la nuqulin..Si aad u ballaadhan, mid ka mid ah borotiinada shahwada ee la yaqaan ee looga baahan yahay wejiga isku dhejinta ee fiyuuska ayaa ah mid aan badnayn.
Wali waa su'aal furan in SPACA6 (iyo xubnaha kale ee IST superfamily) ay ka qaybqaataan isgoysyada isdhexgalka, samee shabakadaha intragametic si ay u qoraan borotiinno muhiim ah dhibcaha fiyuuska, ama laga yaabee xitaa inay u dhaqmaan sida fusogens aan qarsooneyn.Daraasadaha is-difaaca-is-dhaafsiga ee unugyada HEK293T ayaa muujiyay isdhexgalka u dhexeeya dhererka buuxa ee IZUMO1 iyo SPACA632.Si kastaba ha noqotee, ectodomains-kayaga dib-u-soo-celinta ma aysan dhexgalin vitro, taasoo soo jeedinaysa in isdhexgalka lagu arkay Noda et al.Labaduba waa la tirtiray dhismaha (xusuusnow dabada cytoplasmic ee IZUMO1, taas oo la muujiyay in aan loo baahnayn bacriminta62).Beddelkeeda, IZUMO1 iyo/ama SPACA6 waxay u baahan karaan bey'ado xidhitaan gaar ah oo aynaan ku soo saarin vitro, sida qaab-dhismeedka jidh ahaan u gaarka ah ama dhismooyinka molecular oo ay ku jiraan borotiinno kale (la yaqaan ama aan wali la helin).Inkasta oo IZUMO1 ectodomain la aaminsan yahay in ay dhexdhexaadinayso ku-xidhnaanta shahwada ee ukunta ee bannaanka perivitelline, ujeedada SPACA6 ectodomain ma cadda.
Qaab dhismeedka SPACA6 wuxuu muujinayaa dhowr sagxadood oo la xafiday oo laga yaabo inay ku lug yeeshaan isdhexgalka borotiinka-protein.Qaybta la dhawray ee gobolka hinge ee isla markiiba ku dheggan dulucda CXXC (loo qoondeeyey Patch 1 ee sare) waxay leedahay hadhaaga caraf udgoon u soo jeeda oo badan kuwaas oo inta badan la xidhiidha isdhexgalka hydrophobic iyo π-istacking ee u dhexeeya biomolecules.Dhinacyada ballaadhan ee Ig-sida (gobolka 2) waxay sameeyaan jeexdin si togan loo soo oogay oo leh Arg aad loo ilaaliyo iyo hadhaagiisa, iyo unugyada difaaca jirka ee ka soo horjeeda gobolkan ayaa hore loo isticmaalay si loo xakameeyo fusion gamete 30.Antibody-ku waxa uu aqoonsan yahay xuddunta toosan ee 212RIRPAQLTHRGTFS225, kaas oo leh saddex ka mid ah lixda haraaga arginine oo aad loo ilaaliyo His220.Ma cadda in cilladu ay sabab u tahay xannibaadda haraaga gaarka ah ama gobolka oo dhan.Meesha farqiga u dhow ee C-terminus ee β-sandwich waxay muujinaysaa isdhexgalka borotiinka shahwada deriska, laakiin maaha borotiinka oocyte.Intaa waxaa dheer, sii haynta tangle hodan ku ah proline-ka aadka u dabacsan (goobta 3) ee ku dhex jirta hinge waxay noqon kartaa goobta isdhexgalka borotiinka-protein ama, ay u badan tahay, inay muujiso sii haynta dabacsanaanta labada qaybood.Jinsigu wuxuu muhiim u yahay doorka aan la garanayn ee SPACA6.fusion of gametes.
SPACA6 waxay leedahay sifooyin borotiinada adhesion intercellular, oo ay ku jiraan Ig-like β-sandwij.Barootiinno badan oo xabag ah (tusaale, caderins, integrins, adhesins, iyo IZUMO1) waxay leeyihiin hal ama in ka badan oo xayndaabyada β-sandwich ah kuwaas oo borotiinada ka soo qaada xuubka unugga ilaa bartilmaameedkooda deegaanka63,64,65.Qaybta Ig-la mid ah ee SPACA6 waxa kale oo ku jira motif caadi ahaan laga helo β-sandwiches ee adhesion iyo isku xidhka: labanlaabyada xadhkaha barbar socda ee cidhifyada β-sandwiches, oo loo yaqaan clamps makaanikada66.Waxaa la rumeysan yahay in ujeedadani ay kordhiso iska caabinta xoogagga dhogorta, taas oo qiimo u leh borotiinnada ku lug leh isdhexgalka unugyada.Si kastaba ha ahaatee, inkasta oo ay tani u egtahay adhesins, hadda ma jiraan wax caddayn ah in SPACA6 ay la falgasho ukunta cad.SPACA6 ectodomain ma awoodo inay ku xidho JUNO, iyo SPACA6-muujinta unugyada HEK293T, sida halkan ku cad, si dhib leh ula falgalaan oocytes ka maqan zona 32.Haddii SPACA6 ay samayso curaarta intergametic bonds, isdhexgalkan waxa laga yaabaa inay u baahdaan wax ka bedelka turjumaada ka dib ama ay dejiyaan borotiinnada shahwada kale.Taageerada mala-awaalka dambe, shahwada-yaraanta IZUMO1 waxay ku xidhan tahay oocytes, taasoo muujinaysa in molecules aan ahayn IZUMO1 ay ku lug leeyihiin tallaabada ku dheggan gamete 27.
Qaar badan oo ka mid ah borotiinnada fiyuuska ee fayraska, gacanta, iyo korriinka ayaa leh sifooyin saadaaliya shaqadooda fusogens.Tusaale ahaan, fayraska glycoproteins (fasalada I, II iyo III) waxay leeyihiin peptide fusion hydrophobic ama loop dhamaadka borotiinka kaas oo la geliyo xuubka martida loo yahay.Khariidadda hydrophilicity ee IZUMO143 iyo qaab-dhismeedka (la go'aamiyay oo la saadaaliyay) ee qoyska superfamily ee IST ma muujinin peptide fusion hydrophobic muuqda.Sidaa darteed, haddii borotiinno ka mid ah qoyska IST ay u shaqeeyaan sidii fusogens, waxay u sameeyaan si ka duwan tusaalayaasha kale ee la yaqaan.
Gebagebadii, hawlaha xubnaha IST ee qoyska sare ee borotiinada ee xidhiidhka la leh fusion gamete ayaa ah sirta dhalanteed.Unuggeena SPACA6 ee isku-dhafan ee lagu garto iyo qaab-dhismeedkeeda la xaliyay waxay ku siin doontaa aragti ku saabsan xidhiidhada ka dhexeeya qaababkan la wadaago iyo doorka ay ku leeyihiin ku-xirnaanta gamete iyo fusion.
Taxanaha DNA-da ee u dhiganta SPACA6 ectodomain ee bini'aadamka ee la saadaaliyay (Nambarka gelitaanka NCBI NP_001303901.1; hadhaaga 27-246) ayaa loo habeeyay si loogu muujiyo unugyada Drosophila melanogaster S2 waxaana loo sameeyay sida jajab hidde ah oo leh isku xigxiga Kozaknom., calaamada dheecaanka BiP iyo 5'iyo 3' u dhiganta waxay ku dhammaataa ligation-madax-banaan cloning ee hidde-sidahan si uu u noqdo faleebo muujinta pMT oo ku salaysan dhiirrigeliye metallothionein oo lagu beddelay xulashada puromycin (pMT-puro).Xakamaynta pMT-puro waxay dejisaa goobta jeexjeexa xinjirowga oo ay ku xigto sumadda 10x-C-terminal-kiisa (Jaantuska S2).
Kala beddelka xasilloon ee SPACA6 pMT-puro vector ee unugyada D. melanogaster S2 (Gibco) ayaa loo sameeyay si la mid ah borotokoolka loo isticmaalo IZUMO1 iyo JUNO43.Unugyada S2 waa la dhalaaley oo ku koray Schneider's dhexdhexaad ah (Gibco) oo lagu kabay fiirsashada kama dambaysta ah ee 10% (v/v) serum uurjiif kuleyl-ku-ool ah (Gibco) iyo 1X antimycotic antibiyootik (Gibco).Unugyada marinka hore (3.0 x 106 unug) ayaa lagu dhejiyay ceelal gaar ah oo taarikada 6-ceel ah (Corning).Ka dib 24 saacadood oo ku-tiirsanaanta 27 ° C, unugyada waxaa lagu beddelay isku-dar ah 2 mg oo ah SPACA6 pMT-puro vector iyo Effectene wareejinta reagent (Qiagen) sida uu qabo borotokoolka soo saaraha.Unugyada la beddelay ayaa la dhex geliyay 72 saacadood ka dibna waxaa lagu goostay 6 mg / ml puromycin.Unugyada ayaa markaa laga soocay dhexdhexaadiyaha Schneider oo dhammaystiran waxaana la geliyay serum-ka dhexdhexaadka ah ee Cayayaanka-XPRESS (Lonza) ee wax-soo-saarka borotiinka ballaaran.Dufcaddii 1L ee dhaqanka unugga S2 ayaa la koray ilaa 8–10 × 106 ml-1 unug 2 L hawo leh oo daboolan polypropylene Erlenmeyer ka dibna lagu nadiifiyey fiirsashada kama dambaysta ah ee 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) iyo nadiifin nadiif ah.soo jiidan.Dhaqamada la keenay waxaa lagu beeray 27° C. at 120 rpm muddo afar maalmood ah.
Dhex dhexaad ka kooban SPACA6 waxaa lagu go'doomiyay centrifugation at 5660×g at 4°C oo ay ku xigto Centramate tangential flow system sifeynta (Pall Corp) oo leh 10 kDa MWCO xuub.Codso dhexdhexaad ah oo ka kooban SPACA6 ilaa 2 ml Ni-NTA resin agarose (Qiagen) column.Xabagta Ni-NTA waxaa lagu maydhay 10 tiir (CV) ee kaydka A ka dibna 1 CV ee kaydka A ayaa lagu daray si loo bixiyo imidazole ugu dambeeya ee 50 mM.SPACA6 waxaa lagu soo saaray 10 ml oo kayd ah oo lagu kabay imidazole ilaa 500mMHeerka xaddidaadda thrombin (Millipore Sigma) ayaa si toos ah loogu daray tubbada sifaynta (MWCO 12-14 kDa) ee 1 unug halkii mg SPACA6 vs. 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 iyo 150 mM NaCl (buffer B) ee sifaynta.) heerkulka 4°C ilaa 48 saacadood.SPACA6-ka trombobin-jeexan ayaa markaa lagu qasi jiray saddex laab si loo yareeyo xoogga milixda waxaana lagu raray 1 ml MonoS 5/50 GL cation column (Cytiva/GE) oo u dhigma 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.Beddelka cation-ka waxaa lagu maydhay 3 CV oo ah 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, ka dib SPACA6 waxaa lagu soo saaray jaangooyo toosan oo ah 0 ilaa 500 mM NaCl gudaha 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ee 25 CV.Ka dib markii la isweydaarsado chromatography ion, SPACA6 waxaa lagu uruuriyay 1 ml waxaana si gooni ah looga soocay ENrich SEC650 10 x 300 column (BioRad) oo u dhigma buffer B. Marka loo eego chromatogram-ka, barkadda iyo jajabyada xoogga leh ee ka kooban SPACA6.Nadiifinta waxaa gacanta ku hayay Coomassie-stained electrophoresis ee jel 16% SDS-polyacrylamide.Feejignaanta borotiinka waxaa lagu qiyaasey nuugista 280 nm iyadoo la adeegsanayo sharciga Beer-Lambert iyo isku-dhafka dabar-goynta molarka aragtida.
SPACA6 la safeeyey ayaa habeenki laga sifeyay 10 mM sodium phosphate, pH 7.4 iyo 150 mM NaF waxaana lagu qasi jiray 0.16 mg/mL ka hor baadhista CD spectroscopy.Sawirka Spectral ee CD-yada oo leh mowjad dhererkeedu yahay 185 ilaa 260 nm ayaa lagu soo ururiyay Jasco J-1500 spectropolarimeter iyadoo la adeegsanayo quartz cuvettes oo leh dhererka wadada indhaha ee 1 mm (Helma) at 25°C ee heerka 50 nm/min.Muuqaalka CD-ga ayaa la saxay salka, celcelis ahaan in ka badan 10 iibsi, waxaana loo beddelay celcelis ahaan ellipticity (θMRE) ee darajo cm2/dmol:
halka MW uu yahay miisaanka molecular ee muunad kasta ee Da;N waa tirada amino acids;θ waa ellipticity ee millimitir;d waxay u dhigantaa dhererka jidka indhaha ee cm;diirada borotiinka ee unugyada.