310 10 * 1mm Qayb kiimikaad tuubo-duuban oo birta ah, N-terminal domains of spidroin form hydrogels oo ku saleysan fibrillada amyloid waxayna bixiyaan madal loogu talagalay kicinta borotiinka.

Waad ku mahadsan tahay booqashada Nature.com.Waxaad isticmaalaysa nooc browser ah oo leh taageero CSS xaddidan.Waayo-aragnimada ugu fiican, waxaan kugula talineynaa inaad isticmaasho browser-ka la cusboonaysiiyay (ama aad damiso Habka Laqabsiga ee Internet Explorer).Intaa waxaa dheer, si loo hubiyo taageerada joogtada ah, waxaan ku tusineynaa goobta aan lahayn qaabab iyo JavaScript.
Sliders oo muujinaya saddex maqaal sawirkiiba.Isticmaal badhamada dambe iyo kuwa xiga si aad ugu dhex gudubto boggaga, ama badhamada kantaroolaha slide ee dhamaadka si aad ugu gudubto sawir kasta.

Tilmaamid

310 10*1mm alaab-qeybiyeyaal tuubo-duuban oo aan birta lahayn

Halabuurka Kiimikada

Guryaha Makaanikada

Barootiinnada xariirta caarada ee dib-u-dhaqaajinta ah (borotiinnada xariirta caarada) waxay leeyihiin codsiyo badan oo suurtagal ah oo ku saabsan horumarinta biomaterials cusub, laakiin dabeecadahooda kala-duwan iyo isku-darka-u nugul waxay ka dhigtaa inay adagtahay in la helo oo si fudud loo isticmaalo.Halkan waxaan ku soo sheegaynaa in borotiinnada spidroin-yar ee dib-u-dhaqaajinta ah iyo, muhiimad ahaan, N-terminal domain (NT) lafteedu ay si degdeg ah u sameeyaan is-taageerayaal iyo hydrogels hufan at 37 ° C.borotiinada isku dhafka ah ee ka kooban NT iyo borotiinka fluorescent cagaaran ama purine nucleoside phosphorylase waxay sameeyaan borotiinno isku dhafan oo si buuxda u shaqeeya.HydrogelsNatiijooyinkayagu waxay muujinayaan in dib-u-habaynta NT iyo borotiinnada isku-dhafka ah ay bixiyaan wax-soo-saarka muujinta sare waxayna siinayaan hydrogels leh sifooyin soo jiidasho leh sida daahfurnaanta, gelation-ka oo aan lahayn isku-xirnaansho, iyo dhaqdhaqaaq toos ah ee borotiinnada firfircoon ee cufnaanta sare.
Caaradu waxay leedahay ilaa toddobo qaybood oo kala duwan oo qanjidhada xariirta ah, mid walbana wuxuu soo saaraa nooc gaar ah oo xariir ah.Dhammaan toddobada nooc ee xariirta ah waxay ka kooban yihiin borotiinno xariirta caarada ah (spidroins) qiyaastii 6000 hadhaa ah ayaa dheer waxayna ka kooban yihiin gobol weyn oo ku celiska ah oo ay ku hareereysan yihiin N-iyo C-terminal domains (NT iyo CT)1,2.Nooca aadka loo bartay ee xariirta, ampulla-da aasaasiga ah, waxaa soo saara qanjirka 'ampulla' ee aasaasiga ah.Qanjidhkan, monolayer ka mid ah unugyada epithelial waxay isku daraan borotiinnada spidroin waxayna ku sii daayaan lumen qanjirka, halkaasoo ay ku jiraan qaab milmay (doping) oo aad u sarreeya (30-50% w/v) 3,4.Abaabulida iyo isku-dhafka borotiinka spidroin-ka weyn ee qanjidhada ayaa laga dooday, laakiin inta badan caddaynta tijaabada ah waxay muujinaysaa joogitaanka guud ahaan helical iyo / ama qaab-dhismeed helical ah iyo qaab-dhismeedka micellar ama lamellar5,6,7,8,9,10.Halka qaybaha soo noqnoqda ay nidaamiyaan sifooyinka farsamada ee fiilooyinka xariirta ah, samaynta β-sheet nanocrystals iyo qaab-dhismeedka amorphous11,12,13,14,15, dhammaadka domains waxay nidaamiyaan fiilooyinka xariirta iyagoo ka jawaabaya xaaladaha isbeddelka ee qanjidhada xariirta16,17,18.Iyada oo la xakameynayo sameynta xariirta, 19. Xirmooyinka hawada sare ayaa si horumar leh loo ilaaliyaa waxaana laga yaabaa in shaqadooda ay ka siman yihiin dhammaan borotiinka spidroin 2,20,21.Inta lagu jiro marinka qanjidhada, pH ee spidroin waxay hoos u dhacdaa qiyaastii 7.6 ilaa <5.716 waxayna kordhisaa xiirid iyo fidsanaan dhexdhexaadin ah iyada oo loo marayo marinka si tartiib tartiib ah.Xalka, CT waa α-helical constitutive parallel dimer17, laakiin ka jawaab celinta pH hoose iyo xoogagga dhogorta, CT ayaa furfuran oo damisa β-lakab16, 17, oo suurtogal ah inay kiciso β-lakabyada gobollada soo noqnoqda ee Beddelka 16. NT waa monomeric hoos yimaada. Xaaladaha ka tarjumaya xaaladaha lumen ee qanjidhada iyo dhexdhexaadinta milanka spidroin, laakiin pH hoos u dhaca, protonation ee tiro ka mid ah silsiladaha dhinaca carboxylic acid waxay keenaysaa in kala badhida NT oo leh pKa ah qiyaastii 6.5, halkaas oo xasilinta NT iyo hagaajinta spidroin ee waaweyn. tiro.shabakadaha16,18.Haddaba, NT waxa uu door muhiim ah ka ciyaaraa samaynta filaha, isaga oo ka beddelaya monomer ku dahaarka ah una beddelay dimer fiber23,24,25.NT ayaa weli ah mid aad u milmay oo helical iyadoo la raacayo dhammaan shuruudaha la darsay ilaa taariikhda16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, taas oo dhiirigelisay horumarkeeda sidii calaamad xoojinaysa milanka ee soo saarista borotiinnada heterologous.
Recombinant mini borotiin xariir caaro ah, oo ka kooban hal NT, hal gobol ku celcelin gaaban, hal CT, iyo His6 sumadda (His-NT2RepCT) ee daahirinta, waa sida milmi in biyo-biyoodka sida borotiinka xariirta caarada hooyo oo la jaan qaadaya sifooyinka muhiimka ah ee asalka ah ee caarada xariirta. .caymiska 25.31.His-NT2RepCT waxa lagu dhex miiri karaa fiilooyinka joogtada ah iyadoo la isticmaalayo mishiinka biomimetic kaas oo daahan pH 8 milmaya lagu siidaayo pH 525,32,33,34,35 qubeyska biyaha.Halsano bioreactor ee E. coli oo muujinaya His-NT2RepCT iyo daawaynta ka dib waxay keentay> 14 g/L wax soo saar ka dib nadiifinta.Wax-soo-saarka sarreeya, milanka sare, iyo jawaab-celinta ku filan ee His-NT2RepCT ee xaaladaha acidic ayaa dhammaantood loo aaneynayaa NT23, 25, 34.
Halkan waxaan kaga warbixinaynaa samaynta degdega ah ee hydrogels hufan ee borotiinada spidroin recombinant, oo ay ku jiraan NT oo keliya, anagoo ku shubaya xal borotiin ah 37 °C.Isticmaalka thioflavin T fluorescence (ThT), Fourier wuxuu beddelaa spectroscopy infrared spectroscopy (FTIR), nukliyeerka magnetic resonance spectroscopy (NMR) iyo gudbinta mikroskoobyada elektaroonigga ah (TEM), waxaan ogaanay in borotiinnada NT iyo microspider-ka ay isku beddelaan qaabdhismeedka β-sheets iyo amyloid-u eg fibrils marka jeel la sameeyo.Intaa waxaa dheer, borotiinnada fiyuuska ee NT iyo borotiinka fluorescent cagaaran (GFP) ama purine nucleoside phosphorylase (PNP) waxay sameeyaan hydrogels oo leh jajab fiyuusyo si buuxda u shaqeynaya.Muujinta sare-u-qaadista ee marti-geliyaha heterologus, oo ay weheliso samaynta degdegga ah ee hydrogels ee xaaladaha jireed, waxay furaysaa suurtogalnimada wax-soo-saarka kharash-ku-ool ah ee hydrogels oo leh hawlo farsamo.
Si ka duwan inta badan la soo sheegay borotiinnada spidroin-ku-soo-celinta36, His-NT2RepCT waxay ku xasilloon tahay Tris-HCl kaydka pH 8 waxaana lagu uruurin karaa ilaa 500 mg/mL iyada oo aan roob lahayn25.Sidaa darteed, waxaan la yaabnay inaan ogaano in borotiinkani uu si dhakhso ah u sameeyo qaab muuqaal ah oo muuqda, hydrogels is-taageersan marka lagu beero 37 ° C (Jaantus. 1b-d).Daraasado dheeraad ah ayaa muujiyay in His-NT2RepCT gelation ay ka dhaceen tiro balaadhan oo ah uruurinta borotiinka (10-300 mg / mL) iyo in diiraddani ay si aan kala sooc lahayn ula xiriirto wakhtiga gelitaanka (Jaantus. 1c iyo Sawirka Dheeraadka 1).Si aan u ogaano qaybaha His-NT2RepCT ee dhexdhexaadinta samaynta hydrogel, waxaanu markaas baadhnay domain kasta si gaar ah iyo isku-daryo kala duwan annagoo adeegsanayna qiyaas rogaal celin ah (Jaantuska 1a,b).Dhammaan jajabyada la tijaabiyay ee spidroin-ka recombinant sameeyay jel (oo ah qiyaasta borotiinka ee 300 mg/mL) in ka yar 1 saac, marka laga reebo 2Rep degdeg ah (Jaantus. 1b).Tani waxay soo jeedinaysaa in NT iyo CT keligood, marka la isku daro, ama lala xiriiriyo soo noqnoqoshada, ay geli karaan 37°C iyo in summada His6 aysan saameyn ku yeelan habkan ilaa xad la taaban karo.Marka la eego fikradda guud ee ah in NT uu yahay borotiin aad u milmay oo deggan, iyo in warbixinnadii hore ee dib-u-celinta spidroin hydrogels ay u sababeeyeen saamaynta gelitaanka isbeddellada is-beddelka ee gobollada soo noqnoqda iyo/ama CT-yada, NT laftiisa ayaa awood u leh.Helitaanka gelation waxay ahayd lama filaan.Jadwalka Dheeraadka ah 1) 37, 38, 39. Waxaa cajiib ah, NT mar horeba lagu shubay 10 daqiiqo gudahood iyadoo la eegayo ≥ 300 mg/mL (Jaantus. 1c).Tijaabooyin rogaal celis ah oo leh tirooyin kala duwan oo NT ah ayaa muujiyay in> 50 mg/mL xalka NT uu ka dhakhso badan yahay His-NT2RepCT ee u dhigma (w/v, Jaantuska 1c).
Matalaadda qaabdhismeedka spidroin kala duwan oo lagu bartay shaqadan.b Wakhtiga jelka ee 37 °C ee borotiinnada spidroin-ka ee kala duwan (300 mg/mL) ayaa lagu xaqiijiyay iyada oo la rogayo fiisada.Gel CT isla markiiba iyada oo aan la kicin (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, 5 mm scale).c Waqtiga jel ee His-NT2RepCT iyo NT oo ku saabsan uruurinta borotiinka ee 37°C.d Sawirrada His-NT2RepCT iyo NT hydrogels oo leh caarada iyo xarafka "NT" oo hoosta ku daabacan, siday u kala horreeyaan (labadaba 200 mg/mL, cabirka 5 mm).
Hydrogels-yada ay sameeyeen borotiinno spidroin-ka dib-u-dhaqaajiya waxay leeyihiin midabyo xoogaa kala duwan, indha-indheynta indhaha qaawanina waxay muujinaysaa heerar kala duwan oo daahfurnaan ah (Jaantus 1b).Geliyeyaasha NT-du si gaar ah ayey u cad yihiin halka jeelyada kale ay noqdaan kuwo mugdi ah.His-NT2RepCT iyo jellaha NT ee lagu tuuray tuubooyinka cylindrical ayaa laga saari karaa caaryada oo aan hagaagsaneyn (Jaantus. 1d).
Si loo tijaabiyo in dahaarka xariirta caarada dabiiciga ah jel xaaladaha hadda la ogaaday in ay sababto gelation ee borotiinada spidroin recombinant, daahan ayaa laga soo ururiyey qanjirka weyn ee ampulla ee caarada Iswidhan (Larinioides sclopetarius).Dahaarada waxaa lagu kaydiyay 20 mM Tris-HCl kaydka 50 mg/mL (oo ku salaysan miisaanka qallalan ee la qiyaasay), laakiin wax jeexjeex ah lama arag inta lagu guda jiro 21 maalmood ee ku-dhufashada ee 37 ° C (Jaantuska Dheeraadka ah 2a).
Si loo qiyaaso gelyadan, cabbirada rheological waxaa loo isticmaali karaa in lagu barto habka gelitaanka iyo go'aaminta sifooyinka farsamada guud.Gaar ahaan, la socodka modules kaydinta (elasticity) heerkulka sare waxay ku siin kartaa macluumaadka ku saabsan heerkulka gelling iyo sidoo kale sifooyinka viscoelastic ee daahan.Tijaabooyin heerkul ah oo kor u kaca (iyadoo la adeegsanayo 1 ° C / min at 25-45 ° C, oo ku salaysan daraasado hore oo la adeegsanayo xalalka xariirta dabiiciga ah) 40,41 waxay muujisay in moodooyinka kaydinta His-NT2RepCT iyo NT xalalka ay kordheen heerkulka sii kordhaya.ayaa la kordhiyey (Jaantuska 2 iyo Sawirka Dheeraadka ah 3).Waxaa xusid mudan, moduleka NT-gu wuxuu bilaabay inuu ku kordho heerkul hoose marka la barbar dhigo His-NT2RepCT, oo la jaan qaadaya wakhtiga gelitaanka degdega ah ee la arkay markii NT si toos ah loogu galiyay His-NT2RepCT at 37°C (Jaantuska 1).Kadib hoos u dhac ku yimid heerkulka, modules-ka kaydinta kuma soo laaban qiyamka hoose waxayna ka sarraysay moduleska luminta (eeg sawirka Dheeraadka ah 3), taas oo muujinaysa kuleyl aan dib loo celin karin.Jaleecada ka dib, modules laastikada kama dambaysta ah wuxuu u dhexeeyay 15 ilaa 330 kPa ee His-NT2RepCT hydrogels ee fiirsashada 100-500 mg / mL, iyo modules laastikada kama dambaysta ah ee NT hydrogels (100-500 mg / mL) waxay u dhaxaysay 2 ilaa 1400 kPa (Sawirka, 2 iyo xogta ramp oo dhamaystiran) eeg Sawirka Dheeraadka ah 3).
Isbeddelka heerkulka inta lagu jiro cabbirada His-NT2RepCT (300 mg/mL) iyo b NT (300 mg/mL) oo gariiraya.Falaadhuhu waxay muujinayaan isbeddelka heerkulka, iyo hooska khafiifka ah ee xogta moduleka kaydinta waxay muujinaysaa tijaabinta qiyamka qulqulka hoose ee qalabka marka loo eego soo saaraha, taas oo ah sababta buuqa kordhay.c Ururinta dhamaadka-module-ka His-NT2RepCT iyo NT kadib heerkul sare (100, 300, iyo 500 mg/mL).Dhammaan akhrinta moduleka waxaa lagu qaadaa inta jeer ee 0.1 Hz.
Sida habka suurtogalka ah ee lagu baadho isbeddellada is-beddelka ee la xidhiidha gelation, waxaanu diiwaangelinnay FTIR spectra His-NT2RepCT iyo NT ka hor iyo ka dib gelitaanka 37°C (Jaantuska 3a,b).Sida la filayo, muuqaalka His-NT2RepCT iyo xalalka NT waxay u dhigmaan borotiinno muujinaya qaabdhismeedka sare ee α-helix / random gariiradda, oo leh koox lagu dhawaaqay 1645 cm-1.Labada hydrogels, gelation waxay keentay in la sameeyo laba gacmood oo ku yaala bartamaha I band oo ku saabsan 1617 cm-1 iyo 1695 cm-1 (Jaantus. 3a, b), taas oo muujinaysa samaynta qaababka β-sheet antiparallel.Isbeddelladan waxa kale oo si cad loogu arki karaa kala-soocidda labaad iyo kala-duwanaanta kala-soocidda (Jaantuska Dheeraadka ah. 4b).Labada qaybood ee NT β-lakabka ayaa aad uga cadhooday kuwa His-NT2RepCT, taas oo muujinaysa in wadarta guud ee xadhkaha β-lakabka ee NT hydrogel ay ka sarreeyeen ta NT2RepCT.
a FTIR nuugista spectra His-NT2RepCT iyo b NT (labadaba 500 mg/mL) kahor (xalka) iyo ka dib (gel) kuleeminta 37°C.c Sawirada TEM ee dib loo hakiyay 50 mg/ml NT2RepCT jel iyo d NT.Qiyaasta bar 200 nm.e Dhexroorka Fiber ee His-NT2RepCT iyo NT hydrogels.n = 100 fibriil la qiyaasay, p <0.0001.Baararka qaladku waxay muujinayaan weecitaanka caadiga ah.Xuddunta baararka qaladku waa celceliska.Tijaabo t-labo-dabo ah oo aan lammaane lahayn ayaa loo adeegsaday falanqaynta tirakoobka.Fluorescence ThT ee borotiinnada spidroin-ka ee kala duwan (100 mg/mL) oo ah 37 ° C iyada oo aan la ruxin.g NT (100 mg/mL) tijaabada tallaalka laga bilaabo 100 mg/mL NT jel oo leh 0%, 5%, 10%, iyo 20% iniinno.
Falanqaynta jel iyada oo la adeegsanayo microscopy elektarooniga ah (TEM) ayaa muujisay in hydrogel-ku ka kooban yahay fibrillo amyloid ah (Sawirro 3c, 3d).Fibriyada NT-sameeyay ayaa la dheereeyey (5-12 nm dhexroorka) oo aan laamayn, halka His-NT2RepCT fibriilyadu ay ka gaaban yihiin dherer ahaan oo si weyn u ballaaran dhexroorka (7-16 nm) (Jaantus 3e).Natiijooyinkani waxay noo oggolaadeen inaan raacno kaniiniyada fibrosis-ka anagoo adeegsanayna thioflavin T (ThT).Dhammaan borotiinada spidroin-ka ee dib-u-dhaqaajinta ah, calaamadda fluorescent ayaa kordhay markii shaybaarrada lagu darey 37 ° C (Jaantus. 3f, Sawirka Dheeraadka ah. 5a).Iyadoo la raacayo natiijadan, baadhista microscopic ee NT iyo His-NT2RepCT ee xaaladaha gelling-ka ayaa daaha ka qaaday koror labis ah oo fluorescence ThT ah iyada oo aan la ogaan karin ururinta gudaha ee ThT-positive aggregates (Jaantuska Dheeraadka ah 5b,c).Samaynta fibrillada ThT-positive-ka ah lama raacin kororka NT iyo turbidity His-NTCT (Jaantuska Dheeraadka ah. 5d), taas oo macnaheedu yahay in isku-xidhka fibrillada ee jelka uu samayn karo iyada oo aan waxyeello loo geysan caddaynta gel.Abuuritaanka iyadoo lagu darayo xaddi yar oo fibriil hore loo sameeyay waxay si weyn u soo dedejin kartaa samaynta fibriil ee qaar ka mid ah amyloid42,43,44 laakiin ku dara 5%, 10% ama 20% (w/w) NT oo lagu daro xalalka xinjirowga NT.saamaynta abuur (Jaantus. 3g).Waxaa laga yaabaa in tani ay sabab u tahay xaqiiqda ah in fiilooyinka ku jira hydrogel ay yihiin kuwo go'an oo aan loo isticmaali karin sida abuur.
Dabeecadda lama filaanka ah ee borotiinnada spidroin-ka ee heerkulka sare leh ayaa keenay daraasado spectroscopy magnetic resonance (NMR) oo dheeraad ah si loo aqoonsado isbeddellada is-beddelka ee la xidhiidha samaynta jel.Muuqaalka NMR ee xalalka His-NT2RepCT ee la duubay muddo 37°C ah ayaa muujisay in CT-du ay wali qayb laalaabantahay, halka calaamadaha NT iyo 2Rep ay meesha ka baxeen (Jaantus. 4a), oo soo jeedinaysa in ay inta badan ahayd NT iyo 2Rep kuwaas oo qayb ahaan gacanta ku hayay samaynta His- NT2RepCT hydrogel.Calaamadda CT-ga ayaa sidoo kale la yareeyey 20% xooggeedii asalka ahaa, taas oo soo jeedinaysa in CT sidoo kale ay inta badan go'an tahay oo lagu dhex daray qaab-dhismeedka hydrogel.Qayb yar oo ka mid ah CT-ga, taas oo ah sida mobilada sida muunada preincubated oo sidaas lagu arkay xalka NMR, spectra-yada ayaa ka maqan calaamado loogu talagalay 10-ka hadhaaga habaysan ee ugu horreeya, oo ay suurtogal tahay in ay sababto dhaqdhaqaaq adag oo ah qaybta ku lifaaqan His-NT2Rep.Muuqaalka NMR ee -state of hydrogels -NT2RepCT ayaa shaaca ka qaaday joogitaanka ugu badan ee α-helices iyo β-lakabyada iyo, ilaa xad ka yar, isugeynta gariiradda random (Jaantus. 4b).Falanqaynta isbeddelka kiimikada ee hadhaaga methionine ee ku jira NT oo keliya ayaa muujisay in qaybtan loo beddelay qaab-dhismeedka β-sheet.Waqtiga-ku-tiirsanaanta NT ee xalka ayaa muujisay hoos u dhac labis ah oo xoogga signalada ah (Jaantus. 4c), iyo NMR adag ee NT hydrogels ayaa muujisay in inta badan haraaga NT loo beddelay qaab-dhismeedka β-sheet (Jaantus. 4d).Iswaafajinta 2Rep si gaar ah looma go'aamin karayn sababtoo ah u janjeersiga isu geynta.Si kastaba ha ahaatee, xaaladda adag ee NMR spectra ee NTCT iyo His-NT2RepCT hydrogels waxay u ekaayeen kuwo isku mid ah (Jaantus 4b; Sawirka Dheeraadka ahWixii loogu talagalay CT hydrogels, α-helices, β-sheets, iyo qaab-dhismeedka sare ee helical random ayaa la ogaaday inay jiraan (Jaantuska Dheeraadka ah. 6d).Tani waxay soo jeedinaysaa in qaybo ka mid ah CT-gu ay ahaanayaan α-helices halka kuwa kalena ay noqdaan β-sheet.Sidaa darteed, natiijooyinka NMR spectroscopy waxay soo jeedinayaan in NT ay muhiim u tahay samaynta hydrogel oo ay sidoo kale isu beddesho qaabeynta β-sheet marka la isku daro 2Rep iyo CT.Iyadoo la raacayo tan, waxaan dhawaan ogaanay in amyloid spatial zippers ay u badan tahay inay ka sameeyaan dhammaan shanta helice ee domain NT, iyo Waltz algorithm waxay saadaalisay gobolka amyloidogenic ee helix 1 (Jaantus. 4e).
2D spectra of 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT xal ka hor (buluug) iyo 19 saacadood ka dib kuleelinta (casaan) at 37°C.Meelaha ugu sarreeya ee shakhsi ahaaneed ee spectrum cas iyo F24, G136, polyA ee spectrum buluuga ah waxaa lagu tilmaamaa hal xaraf oo amino acids ah iyo lambarada hadhaaga ah.Xirmooyinka ayaa muujinaya ku-tiirsanaanta xoogga calaamaduhu ee waqtiga loogu talagalay hadhaaga la doortay ee NT, 2Rep, iyo CT.b-Muuqaalka Raadiyaha Adag ee Gobolka (RFDR) ee His-NT2RepCT hydrogels.Isku-xidhka hadhaaga Cα/Cβ ee lagu arkay RFDR spectra waxaa lagu go'aamiyay isbarbardhigga moodeelka kiimikooyinka peptide-ka iyo qiyamka laga soo qaatay statistics82,83 iyo dhismayaashooda sare.SSB – garab wareeg ah.c spectra hal-cabbir ah oo ah 15N-HSQC 10 mg/mL NT xalinta inta lagu jiro kuleejka at 37 °C 36 saacadood.Gelinku wuxuu muujinayaa xoojinta mugga iyo waqtiga.d spectra RFDR gobolka adag ee NT hydrogels.Isku xidhka hadhaaga Cα/Cβ iyo qaabdhismadooda sare ee lagu arkay spectra RFDR ayaa la tilmaamay.e Iyada oo ku saleysan NT45.79 astaanta fibrillation profile ka xogta Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Tamarta Rosetta ee daaqada shift ee hillaaca ee hexapeptide waxa lagu muujiyay kcal/mol.Baararka gaduudan waxay tilmaamayaan hexapeptides oo leh fibroosis sare oo u nugul (Tamarta Roseta ee ka hooseeya -23 kcal/mol; ka hooseeya xariiqda dhibcaha leh).Baararka cagaaran waxay muujinayaan jajabyo leh tamarta Rosetta oo ka sarreysa marinka, sidaas darteedna ay u badan tahay inay sameeyaan siibooyin nadiif ah.Jajabyada ay ku jiraan proline ayaa laga saaray falanqaynta (aan lahayn tiirar).Labajibaarayaashu waxay tilmaamayaan meelaha amyloidosis ee uu saadaaliyay Waltz algorithm81 (https://waltz.switchlab.org).Isku xigxiga hadhaaga amino acid ee NT ayaa meesha ugu sareysa, iyo noocyada hadhaaga laga helay qaab dhismeedka β sare (oo lagu go'aamiyay xaalad adag oo NMR spectroscopy) ayaa lagu muujiyay casaan.Booska shanta NT α-helices waxaa loo qoondeeyay sida (H1-H5)28.
Markay tahay pH <6.5, HT way yaraynaysaa, iyada oo u adkaysanaysa kulaylka ama denaturation-ka urea-sababtay18.Si loo caddeeyo sida dimerization-ka NT iyo xasilloonida ay u saameeyaan gelitaanka, xalalka ka kooban 100 mg/ml NT ayaa lagu xakameeyay pH 8, 7, iyo 6 iyadoo la adeegsanayo tijaabada fayl-rogista.Tijaabooyin NT ah oo lagu shubay pH 8 iyo 7 30 daqiiqo ka dib at 37 °C, laakiin pH 8 jel ayaa ahaa mid cad, halka pH 7 gel uu muujiyay roob muuqda (Jaantus. 5a).Taas bedelkeeda, xal ka kooban HT ee pH 6 ma samayn jel, iyo roobab weyn ayaa la arki karaa ka dib 20 min at 37 ° C.Tani waxay soo jeedinaysaa in ay is dhimaan naftooda iyo/ama xasilloonidooda sare marka la barbar dhigo monomers-ka ka hortagga gelitaanka.Samaynta qulqulka NT ee pH 7 iyo 6 lama filayo, tan iyo markii la sheegay in NT uu ku milmay 200 mg / ml27, si fudud dib ugu laabashada ka dib kuleylka kuleylka, sidoo kale wuxuu hayaa α-helix qiimaha hoose ee pH 18. Sharaxaada macquulka ah ee khilaafyadan ayaa ah in tijaabooyinkii hore loo soo sheegay lagu sameeyay heerkulka qolka ama ka hooseeya, ama uruurinta borotiinka yar16,18,19.
Tijaabada rogaal celinta NT vial (100 mg/ml) ee pH 8, 7, 6 iyo 154 mM NaCl (pH 8) ka dib markii la isku dhejiyay 37°C.b NT CD spectra leh iyo la'aan 154mM NaF iyo 154mM NaCl, siday u kala horreeyaan.Ellipticity Molar at 222 nm waxa loo beddelaa qayb laalaabka dabiiciga ah.C NT rogaal celiska (100 mg/ml) NT* (37 °C iyo 60 °C), NTA72R (37 °C), iyo His-NT-L6 (37 °C iyo 60 °C).d muuqaalka CD-ga ee NT mutants NT*, NTA72R, iyo His-NT-L6.Ellipticity Molar at 222 nm waxa loo beddelaa qayb laalaabka dabiiciga ah.e Tijaabada beddelka NTFlSp, NTMiSp iyo NTMiSp oo la dhimay (100 mg/mL).Baaxadda miisaanka 5 mm.f muuqaalka CD ee NT, NTFLSp, NTMiSp iyo NTMiSp oo la dhimay.Ellipticity Molar at 222 nm waxa loo beddelaa qayb laalaabka dabiiciga ah.Muuqaalka NT oo buuxa oo ah 25 °C iyo 95 °C ayaa lagu muujiyey sawirka Dheeraadka ah 8.
Isku-duubnaanta milixda jidhku waxay go'aamisaa isdhexgalka elektrostatic ee ka dhexeeya qayb-hoosaadka NT iyo kala-soocida wareejinta NT ilaa pH18 hoose.Waxaan ogaanay in joogitaanka 154 mM NaCl iyo NaF ay runtii joojiyeen gelation, siday u kala horreeyaan (Jaantus. 5a, b; Sawirka Dheeraadka ah. 2b) iyo in milixyadani ay kordhiyeen xasiloonida kulaylka ee monomers NT (Jaantus. 5b, Sawirka Dheeraadka 8) .Waxa kale oo ay soo jeedinaysaa in xoojinta xasiloonida, halkii ay ka dhalan lahayd, ay ka hortagto sameynta jel.
Si aan u sii sahamno doorka kala-baxa borotiinka iyo xasiloonida gelation, waxaanu isticmaalnay laba mutant, NT* iyo NTA72R, kuwaas oo sidoo kale ku sii ah monomeric pH28.30 hooseeya.NT* waa labajibbaaran rogaal celis ah kaas oo u muuqda qaybinta dallacaadda dipolar ee monomer la simay, kaas oo ka hortagaya kala-baxa oo si weyn u kordhiya xasilloonida monomer.NTA72R waa dipole la dallacay, laakiin Arg-badalay Ala waxa ay ku taal xadka dimer, marka beddelaaddu waxa ay faragelisaa isdhexgalka hoose ee looga baahan yahay kala-saarid.Marka la isku dhejiyo 37 ° C, NT * ma sameynin hydrogel, halka NTA72R ay samaysay jel mugdi ah 15 min (Jaantus. 5c).Mar haddii NT* iyo NTA72R labaduba aysan is dhimi karin, balse ay ku kala duwan yihiin xasilloonida monomer-ka (Jaantus. 5d), natiijooyinkani waxay si xooggan u soo jeedinayaan in xasilloonida heerkulbeegga sare ay ka hortagto NT-ga inuu soo baxo.Tani waxay sidoo kale taageertaa xaqiiqda ah in HT * ay sameyso jel marka ay kacsan tahay heerkulka sare (ka dib 8 min at 60 ° C; Fig. 5c).Waxa hore loo muujiyay in maadada sare ee methionine ee ku jirta NT ay dareerto laalaabkeeda dabiiciga ah iyo in lix Met ilaa Leu beddelka ah (oo halkan loogu yeero His-NT-L6) ay si adag u dejiso monomer-ka NT46.Iyada oo ku saleysan mala-awaalka ah in dabacsanaanta qaab-dhismeedka looga baahan yahay sameynta gel NT, waxaan ogaanay in mutant-ka His-NT-L6 ee deggan uusan ku milmin 37 °C (Jaantus 5c, d).Si kastaba ha ahaatee, His-NT-L6 ayaa sidoo kale sameeyay jel markii la beeray 60°C muddo 60 daqiiqo ah (Jaantus. 5c).
Awoodda NT inuu u beddelo qaab-dhismeedka β-sheet iyo samaynta hydrogels waxay u muuqataa inay khusayso qaar laakiin maaha dhammaan qaybaha NT ee spidroin.NT-yada noocyada xariirta ah ee kala duwan iyo noocyada caarada, Trichonephila clavipes (NTFlSp), waxay samaysteen jeel inkastoo maadada methionine ay aad u hooseyso iyo xasilloonida kulaylka sare (Jaantus. 5e, f iyo Jadwalka Dheeraadka 2).Taas bedelkeeda, NT oo ka soo jeeda borotiinka ampullar spidroin yar oo ka yimid Araneus ventricosus (NTMiSp) oo leh xasilooni kuleyl hooseeya iyo maadada methionine sare ma aysan sameynin hydrogels (Shaxda Dheeraadka ah 2 iyo Fig. 5e, f).Tan dambe waxa laga yaabaa in ay la xidhiidho joogitaanka curaarta disulfide intramolecular 29,47.Si joogto ah, markii curaarta disulfide ee NTMiSp la dhimay, waxay samaysay hydrogel ka dib markii lagu beeray 37 ° C 10 min (Jaantus 5e).Gebogebadii, waa in la ogaadaa in dabacsanaanta qaabdhismeedku ay tahay mid muhiim ah, balse aan ahayn ka keliya, ee cabbirka samaynta jel ka imanaya Axdiga Cusub.Arrin kale oo laga yaabo inay khuseyso ayaa ah u janjeerta sameynta fibrillada amyloid, iyo falanqaynta xogta zipper iyo Waltz algorithm waxay muujisay xiriirka u dhexeeya awoodda sameynta jel iyo joogitaanka gobollada amyloidogenic, iyo sidoo kale baaxadda gobollada la saadaaliyay. si ay u sameeyaan siibooyin steric ah.Waxa jiray xidhiidhin (Shaxda Dheeraadka ah 2 iyo Jaantuska Dheeraadka ah ee 9).
Awoodda NT in uu sameeyo fibriil iyo samaynta jel marka ay jiraan xaalado wanaagsan ayaa noo horseeday in aan qiyaasno in fiyuusyada NT iyo jajabyada borotiinka kale ay wali samayn karaan jel oo leh shaqo buuxda oo ah wada-hawlgalayaasha fiyuuska.Si loo tijaabiyo tan, waxaan ku soo bandhignay borotiinka fluorescent cagaaran (GFP) iyo purine nucleoside fosforylase (PNP) ee C-terminus ee NT, siday u kala horreeyaan.Barootiinada isku-dhafka ah ee ka dhashay ayaa lagu muujiyey E. coli oo leh wax-soo-saarkii ugu dambeeyay oo aad u sarreeya (150 mg/L iyo 256 mg/L rux dhaqamada falaaska ee His-NT-GFP iyo His-NT-PNP, siday u kala horreeyaan), oo waafaqsan waxa la muujiyay. loogu talagalay borotiinno kale oo ku milmay NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) iyo His-NT-PNP (100mg/mL) borotiinnada isku-dhafka ah waxay sameeyeen gels ka dib saacadaha 2 iyo saacadaha 6.5 ee 37 ° C iyo, muhiimad ahaan, qaybta GFP ayaa weli ah mid aan isbeddelin.la arkay ka dib gelation, oo leh> 70% ee xoojinta fluorescence bilowga ah ka dib gelation (Jaantus. 6a).Si loo cabbiro dhaqdhaqaaqa PNP ee xalalkiisa-NT-PNP iyo jel, waa inaan ku qasno borotiinka isku-dhafka ah ee NT sababtoo ah waxqabadka enzymatic ee diyaarinta saafiga ah waxay ka baxsan tahay qiyaasta ogaanshaha ee qiyaasta gelling.Jeelka lagu sameeyay isku dhafka ka kooban 0.01 mg/mL His-NT-PNP iyo 100 mg/mL NT ayaa xajistay 65% ​​dhaqdhaqaaqa enzymatic bilowga ah ee shaybaarada la sii daayay (Jaantus 6b).Jeelku waxa uu ahaan jiray mid dhawrsan intii lagu jiray cabirka (Sawir Dheeraad ah 10).
xoojinta fluorescence qaraabo ka hor iyo ka dib gelitaanka His-NT-GFP (300 mg/mL) iyo fijaan rogan oo ka kooban His-NT-GFP hydrogel (300 mg/mL) hoos muuqda iyo iftiinka UV.Dhibcuhu waxay muujinayaan cabbirada shakhsi ahaaneed (n = 3), baararka khaladku waxay muujinayaan weecan heerka caadiga ah.Celceliska qiimaha waxa lagu muujiyay badhtamaha baararka qaladka.b Dhaqdhaqaaqa PNP waxaa lagu helay falanqaynta fluorometric iyadoo la adeegsanayo xalal iyo jel ka kooban NT (100 mg / ml) iyo isku dar ah oo ka kooban 0.01 mg / ml his-NT-PNP iyo 100 mg / ml Doolarka Taiwan cusub.Gelinku waxa uu tusinayaa fijaan rogan oo ay ku jiraan hydrogel ka kooban His-NT-PNP (bar cabirka 5 mm).
Halkan, waxaan ka warbixineynaa samaynta hydrogels ee NT iyo borotiinnada kale ee spidroin-ka dib-u-dhiska annagoo ku dhejineyno xalka borotiinka 37 ° C (Jaantus 1).Waxaan tusineynaa in gelation ay la xiriirto isbeddelka α-helices ee β-lakabyada iyo samaynta fibrillada amyloid-sida (Sawirro 3 iyo 4).Helitaankan ayaa ah mid la yaab leh maadaama NT-yadu ay yihiin xidhmooyin shan-helix ah oo globular ah oo loo yaqaanno milmayntooda aadka u sarreeya iyo xasilloonida sare ee qiyaasta> 200 mg/mL at 4°C dhowr maalmood27.Intaa waxaa dheer, NT-yadu si sahal ah ayay dib ugu laabteen ka dib markii ay kulku xumaadeen oo ay ku urursan yihiin borotiinka hoose ee µM.Marka loo eego natiijooyinkayaga, samaynta fibriilku waxay u baahan tahay isku-dar ah> 10 mg/mL borotiinka diiradda saaraya iyo heerkul yar oo sarreeya (Jaantus. 1).Tani waxay la socotaa fikradda ah in fibrillada amyloid ay ka sameysan karaan borotiinno isku laabma globularly kuwaas oo ku jira xaalad qayb ahaan aan la furin sababtoo ah isbeddelka kulaylka ee xaaladaha jireed 48.Tusaalooyinka borotiinada la beddelo waxa ka mid ah insulin49,50, β2-microglobulin, transthyretin iyo lysozyme51,52,53.Inkasta oo NT uu yahay α-helix ee waddankiisa hooyo, qiyaastii 65% ee silsiladda polypeptide waxay ku habboon tahay sameynta jilbaha steric (Jaantus. 4e) 45.Maadaama monomer-ku uu dhaqdhaqaaq ahaan firfircoon yahay46, waxay soo bandhigi kartaa gobolladan amyloidogenic ee suurtogalka ah heerkul dhexdhexaad ah oo sarreeya iyo qiyaasta sare ee borotiinka guud waxay gaari kartaa feejignaan muhiim ah sameynta amyloid fibril54.Sababtan awgeed, waxaan helnay xiriir taban oo u dhexeeya feejignaanta spidroin iyo waqtiga gelation (Jaantus. 1c), iyo haddii qaab-dhismeedka monomeric NT lagu xasiliyo ha ahaado isbeddellada (NT*, His-NT-L6) ama ku daridda milixda, waxay ka hortagi kartaa samaynta hydrogels (Jaantus. 5).
Xaaladaha intooda badan, fibrillada amyloid waxay ka baaba'aan xalka sida da'da, laakiin xaaladaha qaarkood waxay samayn karaan hydrogels55,56,57.Fibrillada-samaynta Hydrogel caadi ahaan waxay leeyihiin saami-qaybeed sare waxayna sameeyaan shabakado saddex-cabbir ah oo deggan iyada oo loo marayo isku-xidhka molecular,55,58 oo waafaqsan natiijooyinkayada.Samaynta hydrogel ee vitro, borotiinada inta badan si buuxda ama qayb ayaa loo furfuraa, tusaale ahaan, soo-gaadhista dareerayaasha organic, heerkulka sare (70-90 ° C) iyo / ama pH hooseeya (1.5-3.0) 59,60,61,62.spidroin hydrogels-ka halkan lagu sifeeyay uma baahna farsamayn adag, uma baahna wakiilada isku xidha si ay u xasiliyaan hydrogels-yada.
Waxa hore loo soo sheegay in spidroin soo noqnoqda iyo QDs, kuwaas oo u muuqda inay maraan beddelka β-sheet inta lagu jiro wareegga xariirta, waxay sameeyaan hydrogels.Marka la barbar dhigo natiijooyinkayaga, wakhtiyada kulaylinta iyo/ama kulaylinta heerkulka ayaa si aad ah uga dheeraa ama ka sarreeya, siday u kala horreeyaan, iyo hydrogels-yada ka dhasha inta badan waxay ahaayeen kuwo mugdi ah (Jaantuska 7 iyo Jadwalka Dheeraadka 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Marka lagu daro waqtiyada gelitaanka degdega ah, NT hydrogels> 300 mg / mL (30%) ayaa ka sarreeya dhammaan kuwa kale ee lagu sharraxay borotiinnada xariirta caarada, iyo sidoo kale hydrogels dabiiciga ah sida gelatin, alginate (2%), agar (0.5 % ) iyo collagen.(0.6%) (Jaantuska 7 iyo Jadwalka Dheeraadka ah 1 iyo 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Waqtiga jel-ka iyo moodooyinka laastikada ee hydrogels ee daraasaddan ayaa la barbardhigay hydrogels kale oo ku saleysan spidroin iyo hydrogels dabiiciga ah ee la doortay.Tixraacyada waxaa la socda sharraxa xaaladaha gelitaanka.APS Ammonium persulfate, heerkulka qolka.Xogta 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Caaro-caaro waxay u muuqdaan inay sameeyeen habab looga hortagayo spidroin inay jeelto inta lagu jiro kaydinta.In kasta oo ay aad ugu badan tahay borotiinka qanjidhka xariirta, gobolka soo noqnoqda ee weyn ee la xidhiidha qaybta terminal waxay ka dhigan tahay in fiirsashada muuqata ee NT iyo CT ee qanjidhada ay u dhiganto ku dhawaad ​​10-20 mg/ml, ee xadka daraasaddan.loo baahan yahay in vitro lagu arkay samaynta hydrogel.Intaa waxaa dheer, uruurinta la midka ah ee cusbada 16 waxay dejisay NT, sida qanjidhada xariirta (Sawir 5b).Is-waafajinta NT waxaa lagu daraaseeyay E. coli cytosol waxaana la ogaaday inuu si adag u laalaaban yahay marka loo eego marka la baarayo vitro, taasoo sii muujineysa in milix ama arrimo kale ay ka hortagayaan isku-darka vivo.Si kastaba ha ahaatee, awoodda NT-yada si ay ugu beddelaan faylalka β-sheet ayaa laga yaabaa inay muhiim u tahay samaynta fiilaha waana in lagu baaro daraasadaha mustaqbalka.
Marka lagu daro dhinacyada cusub ee NT-amyloid-sida fibriil iyo samaynta hydrogel ee lagu arkay daraasaddan, waxaan sidoo kale muujineynaa in dhacdadani ay yeelan karto codsiyada biotechnological iyo biomedical (Jaantus. 8).Sida caddaynta fikradda, waxaan ku darsannay NT iyo GFP ama PNP waxaana tusnay in borotiinka isku-dhafka ah uu sidoo kale sameeyo hydrogels marka lagu dhejiyo 37 ° C iyo in qaybaha GFP iyo PNP ay inta badan sii hayaan waxqabadkooda ka dib gelitaanka (Jaantuska 6).Nucleoside phosphorylases waa kiciyayaal muhiim ah oo ka kooban nucleoside analogues75, taas oo ka dhigaysa helitaankeena mid khuseeya warshadaha biopharmaceutical.Fikradda muujinta borotiinnada isku-dhafka ah ee sameeya hydrogels hufan oo ku jira xaalado wanaagsan ayaa u oggolaanaya abuurista hydrogels shaqeynaya oo leh sifooyin wanaagsan oo loogu talagalay codsiyo kala duwan oo kala duwan sida enzyme-ka-baxa, sii-deynta daroogada la xakameeyey iyo injineernimada unugyada.Intaa waxaa dheer, NT iyo NT* waa calaamado muujinta hufan30, taas oo macnaheedu yahay in NT iyo kala duwanaanshaheeda loo isticmaali karo wax soo saarka sare ee borotiinnada fiyuuska ah iyo abuuritaanka borotiinnada bartilmaameedka ah ee aan dhaqdhaqaaqa lahayn ee 3D hydrogels.
NT waa mid milma, α-helical iyo xasilloon oo heerar hoose (µM) iyo 37°C.Isla heerkulku, laakiin marka la kordhiyo uruurinta (> 10 mg/ml), NT waxay samaysaa jeelyo ka kooban amyloid-u eg.Barootiinada isku dhafka ah ee NT waxay sidoo kale sameeyaan jeelyo fibrillar ah oo si buuxda u shaqeynaya, taas oo u oggolaanaysa borotiinno kala duwan in lagu dhaqaajiyo 3D hydrogels iyadoo la adeegsanayo NT.Hoosta: NT (PDB: 4FBS) iyo sawirada shabakadaha fiber-ka iyo qaab-dhismeedka borotiinka ee laxidhiidha (oo loo malaynayo oo aan loo sawirin cabbirka, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4).
Dhismayaashu (eeg Jadwalka Dheeraadka 4 ee liis dhammaystiran oo ay ku jiraan taxanaha amino acid) waxa la isku xidhay plasmid pT7 waxaana loo beddelay E. coli BL21 (DE3).E. coli oo ay ku jiraan plasmids ingineered ayaa lagu tallaalay maraq Luria oo lagu kabay kanamycin (70 mg/l) waxaana lagu koray habeenkii 30°C iyo 250 rpm.Dhaqanka ayaa markaa lagu talaalay 1/100 dhex dhexaad LB oo ka kooban kanamycin waxaana lagu dhaqan geliyay 30°C iyo 110 rpm ilaa OD600 uu gaaray 0.8.Daraasadaha NMR, bakteeriyadu waxay ku kortay M9 dhexdhexaad dhexdhexaad ah oo ka kooban 2 g oo D-glucose 13C (Aldrich) iyo 1 g oo ah ammonium chloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) ee calaamadaynta borotiinka ee isotopes.Hoos u dhig heerkulka ilaa 20 darajo Celsius oo keen muujinta borotiinka 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (fiirsashada kama dambaysta ah).Kadib muujinta borotiinka habeenkii, unugyada waxaa la goostay 7278 × g, 4 ° C 20 min.Pellets-ka unugyada ayaa dib loo hakiyay 20mM Tris-HCl, pH 8, oo la qaboojiyey ilaa isticmaal dheeraad ah.Unugyada dhalaalay waxaa la miiray iyadoo la isticmaalayo khalkhaliyaha unugga (mashiinnada taxanaha TS, Constant Systems Limited, England) ee 30 kPa.Ka dibna lysates waxaa lagu dhajiyay 25,000 g 30 daqiiqo at 4 ° C.Wixii NTMiSp ah, pellet-ka ayaa markaas dib loo hakiyay 2 M HOL, 20mM Tris-HCl, pH 8, iyo sonicated ilaa 2 daqiiqo (2 s on/off, 65%), ka dibna centrifused mar kale at 25,000 xg, 4° C. gudahood 30 daqiiqoMashiinka sare waxaa lagu raray tiirka Ni-NTA, waxaa lagu dhaqay 20mM Tris-HCl, 2mM imidazole, pH 8, ugu dambeyntii borotiinka waxaa lagu soo saaray 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Si loo dhaliyo NT2RepCT iyo NTCT, dheefshiidka xinjirowga dhiigga wuxuu bartaa goobta (ThrCleav) inta u dhaxaysa Isaga iyo NT.Goobaha jeexjeexa xinjirowga ayaa sidoo kale ku jira His-NT-ThrCleav-2Rep (waxay soo saartaa 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (waxay soo saartaa NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (waxay soo saartaa CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT. .* (waxay soo saartaa NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (waxay soo saartaa NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (waxay soo saartaa NTF1Sp), iyo His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (soo saara NTMiSp).Dhismayaasha waxaa lagu dheefshiiday trombobin (1:1000) waxaana lagu sifeyay habeenki 4°C. leh 20mM Tris-HCl, pH 8, iyadoo la isticmaalayo xuubka sifaynta Spectra/Por oo leh marinka miisaanka molecular ee 6-8 kDa.Sifeynta ka dib, xalka waxaa lagu shubaa tiirka Ni-NTA waxaana la ururiyaa dareeraha ka kooban borotiinka xiisaha.Heerarka borotiinka waxaa lagu go'aamiyay in la cabbiro nuugista UV ee 280 nm iyadoo la adeegsanayo isku-dheellitirka baabi'inta borotiin kasta, marka laga reebo NTF1Sp, oo adeegsatay baaritaanka Bradford sida uu qabo borotokoolka soo saaraha.Nadiifinta waxaa go'aamiyay SDS polyacrylamide (4-20%) jel electrophoresis iyo Coomassie midab buluug ah oo dhalaalaya.Borotiinnada waxaa lagu uruuriyay iyadoo la isticmaalayo filtarrada centrifuge (VivaSpin 20, GE Healthcare) ee 4000 xg oo leh 10 kDa miisaan dhimis 20 daqiiqo gudahood.
dhalaali xalinta borotiinka oo si taxadar leh u garaac 150 µl 1 ml oo fijaal septum cad ah (8 x 40 mm Thermo Scientific).Tuubooyinka waa la daboolay oo lagu xidhay baallaha si looga hortago uumiga.Tijaabooyin (n = 3) ayaa lagu beeray 37°C ama 60°C oo si xilliyo ah loo rogo si loo eego gelation.Muunado aan jel lahayn ayaa la kabay ugu yaraan hal toddobaad.Iska yaree NTMiSp curaarta disulfide ee leh 10 mM DTT 10 µM borotiinkii.Si loo falanqeeyo gelation ee dahaarka xariirta caarada dabiiciga ah, caarada buundada Swedish waa la gooyay, labada qanjidhada ugu weyn ee la jaray ayaa la dhigay 200 μl of 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 iyo gooyay si ay u oggolaadaan in dahaarka in ay ka soocaan qanjidhada..Waxyaabaha qanjidhada ku jira waxaa lagu milmay meel kaydin ah, 50 µl si loo go'aamiyo miisaanka engegan (iyada oo lagu shubayo fiilooyinka furan ee 60 °C ilaa miisaan joogto ah) iyo 150 µl oo loogu talagalay gelation at 37 ° C.
Joomatari/qalabka cabbiraadda waxa uu ka samaysan yahay bir aan bir lahayn iyadoo la isticmaalayo saxan barbar socda dhexroorka sare ee 20 mm iyo farqiga 0.5 mm.Kuleyli muunada 25 °C ilaa 45 °C kuna noqo 25 °C heerkul ah 1 °C daqiiqaddii adigoo isticmaalaya saxan hoose oo bir ah oo aan lahayn.Cabbirrada gariirrada ayaa lagu sameeyay inta jeer ee 0.1 Hz iyo gobolka viscoelastic toosan ee walxaha ee culeyska 5% iyo 0.5% ee muunadaha 100 mg / mL iyo 300-500 mg / mL, siday u kala horreeyaan.Isticmaal qolka qoyaanka caadiga ah si aad uga hortagto uumiga.Xogta waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo Prism 9.
Uruurinta infrared (IR) spectra heerkulka qolka laga bilaabo 800 ilaa 3900 cm-1.Qalabka ATR, iyo sidoo kale dariiqa iftiinka ee dhex mara spectrometer, waxaa lagu nadiifiyaa hawo qalalan oo la sifeeyay ka hor iyo inta lagu jiro tijaabada.Xalalka (500 mg / mL si loo yareeyo meelaha ugu sarreeya ee nuugista biyaha ee spectra) ayaa lagu dhejiyay kiristaalo, iyo jel (500 mg / mL) ayaa la sameeyay ka hor intaan la cabbirin ka dibna loo wareejiyay crystals (n = 3).1000 sawir ayaa lagu duubay xal 2 cm-1 ah iyo wareegga waajibaadka eber ee 2. Kala soocida labaad waxaa lagu xisaabiyay iyadoo la adeegsanayo OPUS (Bruker) iyadoo la adeegsanayo kala-saarid kala duwan oo sagaal dhibcood ah.Muuqaalka ayaa caadi ahaan loo dhigay isla gobolka isdhexgalka inta u dhaxaysa 1720 iyo 1580 cm-1 iyadoo la adeegsanayo F. Menges "Spectragryph - Software Spectroscopy Optical".Marka la eego ATR-IR spectroscopy, qoto dheer ee dhexgalka shucaaca infrared ee muunadku wuxuu ku xidhan yahay tirada mowjadaha, taasoo keentay nuugista mowjadaha hoose ee ka hooseeya tirada hirarka sare.Saamayntan looma siximin muuqalada lagu muujiyay berdaha.3 sababtoo ah aad bay u yar yihiin (Jaantuska Dheeraadka ah 4).Sawirada saxda ah ee jaantuskan ayaa la xisaabiyay iyadoo la isticmaalayo software Bruker OPUS.
Mabda 'ahaan, qiyaasid dhammaystiran oo isku-dhafka borotiinka ayaa suurtagal ah ka dib markii la isku halleyn karo oo ka-baxsan qaybaha gudaha amide I ugu sarreeya.Si kastaba ha ahaatee, caqabadaha qaar ayaa ka dhasha ficil ahaan.Qaylada spectrum waxay u muuqan kartaa sida (been) ugu sarreysa inta lagu jiro miyir-beelka.Intaa waxaa dheer, ugu sarreeya sababtoo ah foorarsiga biyaha waxay ku beegan tahay booska amide I peak waxaana laga yaabaa inay lahaato cabbir la mid ah shaybaarada ay ku jiraan xaddi badan oo biyo ah, sida jel-biyoodka halkan lagu bartay.Sidaa darteed, iskuma dayin in aan si buuxda u duminno amide I peak, iyo indha-indhayntayadu waa in la tixgeliyo kaliya si loo taageero hababka kale sida NMR spectroscopy.
Xalalka 50 mg/ml NT iyo His-NT2RepCT ayaa habeenki lagu shubay 37°C.Hydrogelka ayaa markaa lagu qasi jiray 20mM Tris-HCl (pH 8) ilaa 12.5 mg/ml, si fiican loo ruxay oo la tuubeeyey si jelka loo jebiyo.Marka xigta, hydrogel-ka waxaa lagu qasi jiray 10 jeer 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl ee muunada ayaa la marsiiyay shabag naxaas ah oo lagu dahaadhay formvar, muunada xad dhaafka ahna waxaa laga saaray warqad.Tusaalooyinka waxaa lagu dhaqay laba jeer 5 µl oo biyo MilliQ ah waxaana lagu walaaqay 1% uranyl formate 5 daqiiqo.Ka saar wasaqda xad-dhaafka ah warqad nuugaysa, ka dibna hawo ku qalaji shabagga.Sawirka waxaa lagu sameeyay shabaqyadaan iyadoo la adeegsanayo FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN oo ku shaqeynaya 100 kV.Sawirada waxaa lagu duubay x 26,500 iyo x 43,000 weynaynta iyadoo la adeegsanayo kamarad Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany).Muunad kasta (n = 1), 10-15 sawir ayaa la duubay.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ayaa loo isticmaalay falanqaynta sawirka iyo cabbiraadda dhexroorka fiber-ka (n = 100, fiilooyinka kala duwan).Prism 9 ayaa loo isticmaalay in lagu sameeyo t-tijaabooyin aan lammaane lahayn (laba dabo ah).Celcelis ahaan His-NT2RepCT iyo NT fibriilyadu waxay ahaayeen 11.43 (SD 2.035) iyo 7.67 (SD 1.389) nm, siday u kala horreeyaan.Inta u dhaxaysa kalsoonida (95%) waa -4.246 ilaa -3.275.darajooyinka xorriyadda = 198, p <0.0001.
80 µl oo muunado dareere ah oo ay ku jiraan 10 µM thioflavin T (ThT) ayaa lagu cabbiray saddex jeer (n = 3) iyadoo la adeegsanayo xaaladaha taagan iyadoo la isticmaalayo Corning 96-si fiican oo madow oo hoose oo cad ah (Corning Glass 3881, USA).Kala duwanaanshaha fluorescence ayaa la duubay iyadoo la adeegsanayo shaandhada 440 nm iyo shaandhada 480 nm (FLUOStar Galaxy oo ka socota BMG Labtech, Offenburg, Germany).Calaamadaha ThT ma ahayn mid buuxsamay mana damin, maadaama tijaabooyin lagu sameeyay xaddi kala duwan oo ThT ah ayaa la sameeyay iyada oo aan la beddelin xoogga calaamada.Ku duub nuugista 360 nm si loo cabbiro neecawda.Tijaabooyinka abuuritaanka, 100 mg/mL jel ayaa lagu sameeyay 37° C., dib loo hakiyay, waxaana loo isticmaalay abuurista saamiga molar ee 5%, 10%, iyo 20%.Xogta waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo Prism 9.
Ku dhalaali kaydka His-NT2RepCT iyo NT>100 mg/mL barafka oo ku sifee 0.22 µm filter.Xoojinta waxaa lagu xisaabiyay iyadoo lagu cabbiray nuugista 280 nm iyadoo la adeegsanayo Nandrop.Ceelasha saxan 96-ceel madow ah oo aan xidhnayn (Corning) oo leh hoos cad, muunado ayaa lagu qasi jiray 20 mg / ml 20 mM Tris-HCl pH 8 waxaana lagu qasi jiray 5 μM ThT (fiirinta kama dambaysta ah), wadarta guud ee xoogga saarista 50 μl mugga.Muunado ayaa lagu sawiray 10kii daqiqiba 37°C mikroskoob CellObserver (Zeiss) oo leh kanaalka iftiinka la kala qaado iyo shaandhada FITC iyo filtarrada qiiqa ee sawirka ThT.Lens 20x/0.4 ah ayaa loo isticmaalaa sawir-qaadista.Zen Blue (Zeiss) iyo ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ayaa loo isticmaalay falanqaynta sawirka.Gel waxaa sidoo kale laga diyaariyey xalalka NT iyo His-NT2RepCT iyadoo la uruurinayo 50 mg/mL oo ka kooban 20 mM Tris pH 8 iyo 5 µM ThT waxaana lagu dhex galiyay 37°C 90 min.Qaybaha jelka waxaa lagu wareejiyay ceel cusub oo ka kooban 20 mM Tris, pH 8, iyo 5 μM ThT oo ku jira saxan madow oo aan xidhnayn 96 saxan hoose oo nadiif ah.Ku hel fluorescence cagaarka iyo sawirada goobta dhalaalaya 20x/0.4.ImageJ waxa loo isticmaalay falanqaynta sawirka.
Xalka NMR spectra waxaa laga helay 310 K 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometer oo ku qalabaysan QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Muunada NMR ee ka kooban 10 mg/mL borotiin isku mid ah oo lagu calaamadeeyay 13C, 15N, lagu milmay 20mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Isbeddellada kiimikaad ee NT2RepCT ee pH 6.7 ayaa loo isticmaalay in lagu meeleeyo 23 ugu sarreysa spectrum 2D ee 15N-HSQC.
Xagasha sixirka ku wareegaysa spectra adag NMR (MAS) ee 13C, 15N-calaamadaysan hydrogels ayaa lagu duubay Bruker Avance III HD spectrometer at 800 MHz oo ku qalabaysan 3.2 mm 13C/15N{1H} baadhitaan elektaroonik ah.Heerkulka muunada waxaa lagu kontroolaay iyadoo la isticmaalayo gaaska heerkulbeegga ah ee doorsooma 277 K. Laba-cabbir dipole rotational resonance (DARR) 76 iyo dib-u-xidhida soo noqnoqda raadiyaha (RFDR) 77 spectra ayaa lagu helay inta jeer ee MAS ee 12.5 kHz iyo 20 kHz, siday u kala horreeyaan.Isku-tallaabta isku-tallaabta (CP) laga bilaabo 1H ilaa 13C waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo xariiq toosan oo ka bilaabmaya 60.0 ilaa 48.0 kHz at 1H, 61.3/71.6 kHz at 13C (wakhtiga 12.5/20 kHz MAS) iyo wakhtiga xidhiidhka 0.5–1 ms.Spinal6478 kala goynta 73.5 kHz ayaa la isticmaalay intii lagu jiray xog ururin.Wakhtiga iibsigu waxa uu ahaa 10 millise seconds iyo daahitaanka wareeggu waxa uu ahaa 2.5 ilbiriqsi.Isku-xidhka Cα/Cβ-ka-hal-xidhan ee lagu arkay spectra RFDR ayaa loo qoondeeyey iyadoo lagu salaynayo dabeecadaha nooca haraaga-ka-beddelka kiimikaad iyo isku-xirnaanta isku-dhufashada ee spectra DARR.
Xogta Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ayaa loo isticmaalay si loo qiimeeyo u janjeersiga iyo tamarta Rosetta ee NT, NTFLSp, iyo NTMiSp.Kaydka Zipper wuxuu xisaabiyaa Rosetta Energy80, kaas oo isku dara dhowr hawlood oo tamar bilaash ah si loo qaabeeyo loona falanqeeyo qaab dhismeedka borotiinka.Heerka tamarta ee -23 kcal/mol ama ka hooseeya waxay muujinaysaa u janjeera sare ee fibrillada.Tamarta hoose waxay ka dhigan tahay xasillooni dheeraad ah ee labada β-strands ee ku jira qaabka siibka.Intaa waxaa dheer, Algorithm-ka Waltz waxaa loo isticmaalay in lagu saadaaliyo gobollada amyloidogenic ee NT, NTFLSp iyo NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Xalka borotiinka NT waxaa lagu qasay 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) kaydiyaha pH 5.5 iyo 6.0 si loo yareeyo pH ilaa pH 6 iyo 7, siday u kala horreeyaan.Xaddiga borotiinka ee ugu dambeeya wuxuu ahaa 100 mg/ml.
Cabbiraadyada waxaa lagu sameeyay J-1500 CD spectrometer (JASCO, USA) iyadoo la adeegsanayo cuvette 300 μL ah oo leh dariiq indho fiiqan oo ah 0.1 cm.Barootiinnada ayaa lagu qasi jiray 10 μM (n = 1) gudaha 20 mM fosfateed kaydiye (pH 8).Si loo falanqeeyo xasilloonida borotiinka ee joogitaanka milixda, borotiinnada ayaa lagu falanqeeyay isla diiradda (n = 1) ee 20 mM phosphate buffer (pH 8) oo ka kooban 154 mM NaF ama NaCl, siday u kala horreeyaan.Sawirada heerkulka ayaa la duubay 222 nm laga bilaabo 25°C ilaa 95°C iyada oo heerka kulaylku yahay 1°C/daqiiqo.Saamiga borotiinada isku laabma asal ahaan waxaa lagu xisaabiyay qaacidada (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Intaa waxaa dheer, shan spectra ayaa la duubay muunad kasta laga bilaabo 260 nm ilaa 190 nm at 25 ° C iyo ka dib kuleylka ilaa 95 ° C.Shan spectra ayaa la isku celceliyay, la simay waxaana loo rogey garaadka molarka.Xogta waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo Prism 9.
Xoojinta fluorescence ee His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) waxaa lagu cabiray saddex geesoodka (n = 3) ee 96-wanaagga taarikada Corning oo leh hoos madow oo hufan (Corning Glass 3881, USA) ee hoos yimaada xaaladaha taagan.Ku cabbir muunado akhristaha saxan ku salaysan fluorescence oo leh hirar xamaasad leh oo ah 395 nm oo ku duub qiiqa 509 nm ka hor gelation iyo 2 saacadood ka dib 37°C.Xogta waxaa lagu lafa guray Prism 9.
Qalabka tijaabinta firfircoonida ee purine nucleoside phosphorylase (habka fluorometric, Sigma Aldrich) ayaa loo isticmaalay si waafaqsan tilmaamaha soo saaraha.Si loo cabbiro dhaqdhaqaaqa gelyada iyo xalalka uu ku jiro His-NT-PNP, ku qas 10 ng oo His-NT-PNP ah 100 mg/mL NT ilaa mugga guud ee 2 µL sababtoo ah jelku wuxuu siiyay calaamad ka sarreysa inta u dhaxaysa muddada ogaanshaha ee go'an.Xakamaynta jelka iyo xalalka aan lahayn His-NT-PNP ayaa lagu daray.Cabbirrada waxaa la fuliyay laba jeer (n = 2).Ka dib marka la cabbiro hawsha, isku darka falcelinta ayaa la saaray oo jel ayaa la sawiray si loo hubiyo in jelku uu sii ahaado inta lagu jiro cabbirka.Xogta waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo Prism 9.
Macluumaad dheeraad ah oo ku saabsan naqshadaynta daraasadda, eeg daraasadda dabeecadda ee ku xidhan maqaalkan.
Jaantusyada 1 iyo 2 waxay soo bandhigayaan xogta bilowga ah.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, iyo 6, Tusaha Dheeraadka ah.3, fig dheeri ah.5a, d, fig dheeri ah.6 iyo berdaha dheeriga ah.8. Xogta daraasaddan waxaa lagu hayaa kaydka Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Xogta NMR ee lagu helay daraasaddan waxaa lagu dhejiyay kaydka BMRBig ee hoos yimaada aqoonsiga gelitaanka bmrbig36.Qaab dhismeedka GFP iyo PNP waxaa laga soo qaatay PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Kor u kaca, A. iyo Johansson, J. Laftirka xariirta caarada macmalka ah.Kiimikada Qaranka.bayoloji.11, 309-315 (2015).
Babb, PL iyo al.Nephila clavipes genome waxa ay muujisaa kala duwanaanshaha hiddo-wadaha xariirta caarada iyo muujintooda kakan.Genette Qaranka.49, 895-903 (2017).