347 Qayb kiimiko ah oo tuubo ah oo bir ah oo duuban, Aqoonsiga novel interferon-ka jawaab celinta borotiinnada leukocyte antigen-A (HLA-A) iyadoo la adeegsanayo spectrometry mass spectrometry (CLMS)

Waad ku mahadsan tahay booqashada Nature.com.Waxaad isticmaalaysa nooc browser ah oo leh taageero CSS xaddidan.Waayo-aragnimada ugu fiican, waxaan kugula talineynaa inaad isticmaasho browser-ka la cusboonaysiiyay (ama aad damiso Habka Laqabsiga ee Internet Explorer).Intaa waxaa dheer, si loo hubiyo taageerada joogtada ah, waxaan ku tusineynaa goobta aan lahayn qaabab iyo JavaScript.
Sliders oo muujinaya saddex maqaal sawirkiiba.Isticmaal badhamada dambe iyo kuwa xiga si aad ugu dhex gudubto boggaga, ama badhamada kantaroolaha slide ee dhamaadka si aad ugu gudubto sawir kasta.

Sharaxaada Alaabta

Tuubooyinka gariiradda leh ee 347L, Heerka Birta: SS347L

Nidaamka calaamadaynta interferon wuxuu keenaa jawaab celin xoog leh oo cytokine ah oo loogu talagalay calaamado badan oo cudur-sidaha ah iyo kuwa gudaha ah ee deegaanka, taasoo keentay in la soo saaro qaybo ka mid ah borotiinnada interferon-inducible.Waxaan codsanay DSS-dhexdhexaadin mass spectrometry-ka-isku-tallaabta ah (CLMS) si loo ogaado isdhexgalka borotiinka iyo borotiinka cusub ee qaybta borotiinnada interferon-ku-abuuray.Marka lagu daro borotiinnada interferon-inducible ee la filayo, waxaan sidoo kale aqoonsanay xirmooyinka isdhaafsiga ah ee interferon-ku-xiran ee cusub sida MX1, USP18, OAS3, iyo STAT1.Waxaan diirada saarnay ansaxinta orthogonal ee isku dhafka cusub ee shabakadaha borotiinka interferon-inducible ee ay sameysteen borotiinnada HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) iyadoo la adeegsanayo is-difaaca jirka iyo daraasaddooda dheeriga ah iyadoo la adeegsanayo qaabaynta dhaqdhaqaaqa unugyada.Naqshadeynta dhaqdhaqaaqa isbedbeddelka ee isku-dhafka borotiinka ayaa shaaca ka qaaday dhowr goobood oo is dhexgalka kuwaas oo ka tarjumaya isdhexgalka lagu aqoonsaday natiijooyinka CLMS.Si wada jir ah, waxaanu u soo bandhigaynaa daraasad tijaabo ah oo ku saabsan CLMS si loo aqoonsado dhismooyinka cusub ee calaamadaha ee uu keeno interferon, waxaanan rajeyneynaa isticmaalka ballaaran ee CLMS si loo aqoonsado dhaqdhaqaaqyada cusub ee isdhexgalka borotiinka ee buro microenvironment.
Ka hor inta aysan bilaabmin jawaab celinta difaaca la qabsiga, nidaamka difaaca gudaha ee martida loo yahay ayaa kor u qaada jawaab celinta ka hortagga jeermiska oo ay dhexdhexaadiyaan qoys ka kooban cytokines alfa-helical sir ah oo loo yaqaan interferon (IFNs).Nooca I IFN fasalada IFNa iyo IFNβ waxay dhaqaajiyaan jawaabaha gacanta, oo ay ku jiraan ka-hortagga fayraska, proapoptotic, bararka, iyo dawladaha ka hortagga proliferative.Bini'aadamka, 13 nooc ee IFNα waa la yaqaan, dhammaantood waxay ku urursan yihiin koromosoomyada 91. Waxaa la yaab leh, kaliya IFNα2 ayaa loo bartay isticmaalka kiliinikada.Dhawaan, fiiro gaar ah ayaa la siiyay cilmi-baarista noocyada kale ee IFNα.Daraasad dhowaan la sameeyay ayaa muujisay in IFNα14 ay tahay mid ka mid ah isoforms-yada ugu waxtarka badan ee xaddidaya HBV2 iyo HIV-13,4 marka la barbar dhigo nooca IFNα2 ee kanonical.
Waxaa la dejiyay in fir fircoonida nooca I interferon reseptor complexes (IFNAR1 iyo IFNAR2) ay kiciyaan calaamad gudbinta calaamadda oo ay dhexdhexaadinayaan Janus kinases TYK2 iyo JAK15,6.Kuwan Janus kinases phosphorylate transducers iyo firfircoonayaasha borotiinka qoraalka ah (STAT1 iyo STAT2) ee hadhaaga tyrosine si ay u bilaabaan SH2 domain-dhexdhexaadin heterodimerization6.Ka dib, IRF9 waxay xidhaa STAT heterodimers si ay u sameyso iskudhaf trimeric ah oo ah IFN-stimulated factor 3 gene (ISGF3), kaas oo u beddela xudunta oo keenta in ka badan 2000 hiddo-kicinta interferon-stimulated (ISGs) 5,6,7,8.
ISGs waxay sameeyaan laf-dhabarta habka difaaca jirka, gaar ahaan ka jawaabista weerarka fayraska.Sida safka koowaad ee difaaca ka hortagga caabuqa fayraska, unugyadu waxay si degdeg ah u geeyaan isdhexgalka ballaaran ee borotiinnada gacanta oo leh hawlo badan oo bayooloji ah.Borotiinnadan waxaa ka mid ah soo-dhoweeyayaasha aqoonsiga qaabka, unugyo calaamadeeynaya, qodobbada qoraalka, iyo borotiinada leh hawlo fayruska tooska ah, iyo sidoo kale maamulayaasha taban ee jawaabaha difaaca.Inta badan macluumaadka ku saabsan waxqabadka ISG waxay ka yimaadaan shaashado shaqeynaya iyadoo la isticmaalayo shaashado xad dhaaf ah10,11 ama farsamooyinka aamusinta hidda-wadaha (siRNA, RNAi iyo CRISPR) 12,13 kuwaas oo ISG-yada shakhsi ahaaneed lagu muujiyo ama la joojiyo oo hawshooda lagu tijaabiyo fayrasyo ​​kala duwan.Inkasta oo daraasadahani ay go'aamiyeen sifooyinka ka hortagga fayraska ee ISG-yada shakhsi ahaaneed, hababka molecular ee hoose ee ISG kasta ayaa weli ah mid aan la garanayn.Guud ahaan waa la aqbalay in borotiinno badani ay la falgalaan hal ama in ka badan oo cytokines ah si loo hubiyo dhaqdhaqaaq buuxa, markaa ISG-yada ayaa si toos ah u falgala ama isdhexgalkooda waxaa dhexdhexaadiya borotiinnada gacanta.Tusaale ahaan, daraasad dhowaan la sameeyay oo sawir-qaadis ah oo proteomics ah ayaa lagu aqoonsaday ATPase VCP/p97 oo ah lammaane weyn oo isdhexgalka IFITM3, kaas oo xannibadiisu ay keento cilladaha kala-soocidda lysosomal, wareejinta, iyo isu-socodka IFITM3 oo leh qaybo fayras ah 14.Isticmaalka tallaalka difaaca jirka, waxaan aqoonsannay VAPA, borotiinka la xidhiidha vesicle-ka, sida lammaane isdhexgalka IFITM1 / 2/3 kaas oo dhexdhexaadiya kolestaroolka dhexdhexaadinta kolestaroolka kolestaroolka fayruuska, iyo tan waxaa xaqiijiyay daraasad kale iyada oo la adeegsanayo habka khamiirka laba-hybrid.Taageerada Sayniska 15 , 16 .
Habka bayoolojiga aasaasiga ah ee ku lug leh xakamaynta caabuqa iyo isbeddelka xun waa soo bandhigida antigen-ka, kaas oo ay dhexdhexaadiyaan unugyada waaweyn ee histocompatibility complex (MHC).Peptides (8-12 amino acids dheer) oo ka soo jeeda borotiinno la gooyey, hore loo joojiyay ama la qalday ayaa lagu shubaa MHC-I heterodimer (oo ka kooban MHC-I silsilado culus iyo kuwo fudud, oo loo yaqaan β-2-microglobulin; β2M) 17,18.MHC-I trimers xasilloon oo ka soo baxay ayaa loo raray dusha unugyada, halkaas oo ay ku soo bandhigaan peptides-ka unugyada CD8+ T unugyada (unugyada cytotoxic T)17.Unugyada T waxay aqoonsadaan oo burburiyaan cudur-sidahaan iyo unugyada sidda antigen-ka gaarka ah ee buro.Sidaa awgeed, cudur-sidaha iyo unugyada burooyinka ayaa inta badan xakameeya habka soo jeedinta antigen-ka si looga fogaado ilaalinta difaaca.Intaa waxaa dheer, MHC-I waxaa lagu dhimay 40-90% ee burooyinka bini'aadamka waxaana badanaa lala xiriiriyaa saadaasha liidata19.
Hidde-yaasha ku lug leh ka jawaabista cudur-sidaha waa in ay si degdeg ah u kala beddelaan xaalad nasasho iyo xaalad qoraal ah oo firfircoon.Sidaa daraadeed, dhowr borotiinno unugyo ah ayaa la qiyaasayaa inay ku lug leeyihiin jawaabta baahida sare ee IFN muddo gaaban, oo ay ku jiraan dib-u-qaabaynta iyo wax ka beddelka chromatin 20,21 dhiirrigeliye.Daraasadaha intooda badani waxay diiradda saareen aqoonsiga shakhsi ahaaneed ee wada-hawlgalayaasha borotiinka ISG ee joogitaanka IFN.Dhowr daraasadood oo borotiinno iyo transcriptomic ah oo ku jira nidaamyada unugyada moodeelka ayaa iftiimiyay saameynta IFN ee muuqaalka gacanta.Si kastaba ha ahaatee, inkasta oo fahamka sii kordhaya ee dhaqdhaqaaqa ay keeneen interferons, waxaan weli wax yar ka ognahay ku lug lahaanshaha ISG-yada.Marka la tixgeliyo kakanaanta iyo dhaqdhaqaaqa waqtiga-ku-tiirsanaanta calaamadaha interferon, laba su'aalood ayaa soo baxaya: (i) suurtagal ma tahay in la dejiyo oo dabinno isku-dhafka borotiinka badan ee ku lug leh calaamadaynta degdegga ah, iyo (ii) isdhexgalkaas ma lagu samayn karaa meel bannaan oo 3D ah?
Si wax looga qabto arrimahan, waxaanu hirgelinay disuccinimide subrate-mediated chemical cross-linking (DSS) oo ay weheliso spectrometry mass spectrometry (CLMS) si aan u barano shabakada isdhexgalka borotiinka ee IFNa iyo dhaqdhaqaaqyadeeda.DSS waxa ay ku darsataa xidhidhyo isku xidhan oo u dhexeeya hadhaaga borotiinada iyo/ama isku xidhka borotiinka ee vivo.Falanqaynta MS ee dambe waxay daaha ka qaadaysaa goobo gaar ah oo isku xidha kuwaas oo ka tarjumaya isu-dhowaanshaha meelaha ee gobollada ku jira borotiin gaar ah, oo loo yaqaan isku-xidhka gudaha, ama qaybaha borotiinnada, ee loo yaqaanno is-dhexgalka.Isticmaalka habkan, waxaanu aqoonsannay dhowr isku dhis oo borotiin iyo borotiinno cusub ah iyo sidoo kale shabakadaha isdhexgalka borotiinka badan ee interferon-ka.Markaan sii tijaabino qayb ka mid ah isdhexgalka cusub, waxaan muujineynaa in H2BFS (H2B histone-nooca FS; hadda ka dib loo tixraaco H2B) iyo MDN1 ay u dhaqmaan sidii shuraakado isku xiran ee HLA-A.
Unugyada Flo-1 waa mid ka mid ah moodooyinka ugu caansan ee loo yaqaan 'vitro model' ee adenocarcinoma hunguriga maadaama ay ku ekaadaan astaamaha muhiimka ah ee burooyinka hunguriga22,23.Si kastaba ha noqotee, dhammaan burooyinka maaha kuwo difaaca jirka ah, iyo si loo go'aamiyo haddii unugyada Flo-1 ay ka jawaabaan daaweynta interferon, waxaan ku daawnay unugyada Flo-1 10 ng / ml IFNa saacadaha 72.Unugyada Flo-1 waxay muujiyeen hor-u-qaadistii pSTAT1 iyo IRF1, laga bilaabo 2 saacadood ka dib daaweynta oo sii socota saacadaha 72, oo leh wakhti ku-tiirsanaan hoos u dhac ku yimaada heerarka taagan ee IRF1 (Jaantus 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, iyo ISG15) ayaa la ogaaday in si xoog leh loo kiciyay ka dib saacadaha 6, iyaga oo la jaanqaadaya jawaabaha wajiga dhexe iyo dambe ee IFNα (Jaantus 1A).Si wada jir ah, xogtani waxay soo jeedinaysaa in qaabkan gacanta loo isticmaali karo in lagu barto jawaabaha interferon.
Jawaabaha muujinta borotiinka ee kala duwan ee unugyada Flo-1 ka dib daaweynta IFNa.(A) Muujinta borotiinka ee unugyada Flo-1 oo lagu daaweeyay 10 ng/ml IFNα 2, 6, 24, 48 iyo 72 saacadood ayaa lagu falanqeeyay immunoblot iyadoo la adeegsanayo unugyada ISG ee la tilmaamay.(B) Coomassie buluug midabaysan oo SDS-PAGE jel ah oo ka kooban unugyo dhan ka dib markii ay isku xidheen DSS wakhtiyada iyo uruurinta.(C) Wakiilka difaaca jirka ayaa lagu baadhay p53(DO-1) antibody laga soo qaaday isla shaybaarro si loo qiimeeyo heerka isku xidhka borotiinka.
Si aan u qabsano muuqaalka is dhexgalka borotiinka ee goobta, waxaanu isticmaalnay DSS, oo ah walax si weyn loo isticmaalo oo isku xidha isku xidhka xuubka sare iyo wakhtiga falcelinta oo gaaban.Waqtiga falcelinta gaaban waxay ka caawisaa ka hortagga samaynta isku-darka ballaaran ee borotiinnada isku-dhafan, taas oo ilaalinaysa xasilloonida is-dhaafsiga.Si loo go'aamiyo fiirsashada ugu fiican ee DSS oo aan uga fogaano isku-tallaabta-dhaafka ah, waxaan marka hore u bandhignay unugyada 5, 2.5, iyo 1 mM DSS 5, 10, 5, iyo 30 daqiiqo, siday u kala horreeyaan, waxaana u falanqeeyay lysates-ka SDS-PAGE ee Coomassie. (xogta lama muujin) .Unugyada unugyada waxay u muuqdaan kuwo si heer sare ah isugu xiran marka la eego xoogga ugu hooseeya iyo waqtiga ugu gaaban.Sidaa darteed, DSS waxaa lagu qiimeeyay 1, 0.5, iyo 0.1 mM in ka badan 5 daqiiqo (Jaantuska 1B).Isku xidhka ugu fican ayaa lagu arkay 0.5 mM DSS mudo 5 daqiiqo ah, waxaana xaaladahan loo doortay unugyada lagu daweeyay IFNa.Intaa waxaa dheer, Jaantuska 1C wuxuu muujinayaa xayndaab reer galbeed ah oo la sameeyay iyadoo la adeegsanayo p53 (DO-1) antibody si loo qiimeeyo heerka isku xirka borotiinka.
Unugyada Flo-1 waxaa lagu daaweeyay 10 ng/ml IFNα saacadaha 24 ka hor inta aan lagu darin iskutallaabaha.Unugyada isku-xiran ayaa markii dambe lagu liibay laba-tallaabo borotiijiyeyaasha iyo borotiinada waxaa farsameeyay FASP (Jaantus. 2)24,25.peptides-ka isku-xiran ee isku-xiran ayaa lagu falanqeeyay spectrometry mass (Jaantus. 2).spectra MS/MS ayaa markaa la mid ah isku xigxiga borotiinka waxaana lagu qiyaasaa MaxQuant26,27.peptides-ku-xiran oo isku-xiran ayaa laga aqoonsaday spectra-yada la helay iyadoo la adeegsanayo barnaamijka SIM-XL, iyo xeryahooda gaarka ah ayaa lagu daray shabakad adag iyadoo la adeegsanayo xQuest28 iyo SIM-XL29 dhuumaha kombuyuutarrada software-ka furan (Jaantus 2).SIM-XL waxay tilmaamaysaa isdhexgalka borotiinka-proteinnada, silsiladaha gudaha iyo silsiladaha gaarka ah ee isku dhafka borotiinka fudud ama kakan waxayna siisaa qoraallo lagu muujinayo isdhexgalka qaab dhismeedka borotiinka.Intaa waxaa dheer, waxay u darajaynaysaa tixraac kasta oo iskutallaab ah sida dhibcaha aqoonsiga iyadoo loo eegayo tayada spectrum MS/MS29.Dhowr is dhexgalka borotiinka-protein-ka oo aad loogu kalsoon yahay ayaa la aqoonsaday, iyo isdhexgal cusub oo dheeraad ah ayaa la baadhay iyadoo la adeegsanayo is-difaacidda is-difaacidda iyo is-beddellada isku-dhafka ah ee isku-dhafan iyadoo la adeegsanayo qaab-dhismeedka molecular (MD) qaabaynta (Jaantus 2) 30, 31.
Dulmar qaabaysan ee habka CLMS.Unugyada Flo-1 waxaa lagu daaweeyay 10 ng/ml IFNα saacadaha 24 oo ay ku xigto isku xirka borotiinka situ iyadoo la adeegsanayo DSS oo ay ku xigto lysis unug iyo trypsinization.Tijaabooyin isku-xiran ayaa lagu falanqeeyay iyadoo la isticmaalayo spectrometer mass Orbitrap waxaana laga sii qaaday muunad si loo kala qaybiyo horudhacyada peptide inta lagu jiro LC-MS/MS.Labo peptides oo isku xiran ayaa laga aqoonsaday spectra-yada la helay iyadoo la adeegsanayo Mashiinka Aqoonsiga Spectrum ee barnaamijka Peptides Crosslinked (SIM-XL), dhammaan xeryahooda waxaa lagu daray shabakad adag iyadoo la adeegsanayo dhuumaha xisaabinta.Sifee isdhexgalka kalsoonida hoose ee ku salaysan buundooyinka heerka beenta ah (FDR).Dhawr is dhexgalka borotiinka-barootiinka-kalsooni sare leh ayaa la sii xaqiijiyay iyadoo la adeegsanayo is-difaac-is-difaac, iyo isbeddellada is-beddelka ee dhismooyinka ayaa la baaray iyadoo la adeegsanayo qaabaynta dhaqdhaqaaqa unugyada (MD).
Wadarta ~ 30,500 iyo ~ 28,500 peptides ayaa lagu ogaadey iyadoo la adeegsanayo MaxQuant ee muunadaha IFNα aan kicin iyo kicin, siday u kala horreeyaan (Shaxda Dheeraadka ah S1, Jaantus. 3A).Qaybinta dhererka peptide ee labada xaaladoodba waxay muujisay saamiga sare ee peptides weyn, taas oo muujinaysa joogitaanka peptides-ku xiran (Jaantus 3B, C).Intaa waxaa dheer, qayb weyn oo ah peptides weyn ayaa ku jiray 40-55 ee shaybaarada IFNa-la daweeyay (Jaantus. 3C).Khariidaynta borotiinka ee ka soo horjeeda xoojinta log2 waxay muujisay in borotiinnada interferon-kicinta caadiga ahi ay yihiin kuwa ugu badan marka loo eego muunado aan la daawayn, oo ay ku jiraan MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, iyo HLA-F (Jaantuska 3D).Falanqaynta dariiqyada borotiinnada in ka badan saddex laab oo lagu kobciyo jawaabta daaweynta IFNα iyadoo la adeegsanayo xogta dariiqa Reactome waxay muujisay in MHC-I-dhexdhexaadinta antigen soo bandhigida iyo ka-hortagga ay ahayd dariiqa ugu sarreeya (Jaantuska 3E).Iyadoo la raacayo warbixinadii hore, jawaabaha ka-hortagga fayraska ee ay dhexdhexaadiyeen OAS iyo ISG15 iyo sidoo kale IFNα / β iyo calaamadaynta cytokine ayaa ka mid ah waddooyinka la hawlgeliyay.Intaa waxaa dheer, isku xirka borotiinka lysine-iyo serine-gaar ah ayaa laga aqoonsaday MS/MS spectra markii hore la helay iyadoo la isticmaalayo SIM-XL.Daraasad dhowaan la sameeyay ayaa lagu sheegay 104 ISGs oo ka kooban 20 fayras oo ka socda 9 fayraska iyadoo la falanqeeyay maadada daraasadaha ISG ee shakhsi ahaaneed ee 5 nooc.Si kastaba ha ahaatee, si aan uga gudubno xaddidaadda xisaabinta ee baaritaanka xog-ururinta, waxaan ku bilownay xog-ururin yar si aan u sahamiyo isdhexgalka suurtagalka ah ee u dhexeeya liiska hiddo-wadaha IRDS ee ay soo tebiyeen Padaria et al., kuwaas oo intooda badan ISGs ah.
Aqoonsiga borotiinnada isku-dhafan ee si kala duwan loo muujiyay iyadoo laga jawaabayo IFNα (xogta laga helay MaxQuant).(A) jaantuska Venn oo ka dhigan tirada peptides-ka caadiga ah iyo kuwa gaarka ah ee lagu aqoonsaday IFNα14 la daweeyay iyo muunadaha Flo-1 ee aan la daawayn.Dhererka Peptide ee qaybinta aan la daawayn (B) iyo IFNα daaweeyay (C) muunado isdhaafsan.(D) Khariidadda kulaylka oo ka dhigan log2 (Xoojinta LFQ) inta u dhaxaysa aan la daawayn iyo IFNα14 daaweeyay unugyada Flo-1.Qaybta bidix waxay muujinaysaa borotiinada sida aadka ah u firfircoon ee joogitaanka IFNα.(E) Histogram ka matalaya 20 dariiqooyinka kobcinta waaweyn ka dib daawaynta IFNα.Xogta dariiqa Reactome waxay falanqeysay in ka badan afar-laab isbeddelada borotiinnada ka jawaaba IFNα.
Dhiirigelinta ISG-dhexdhexaadinta interferon si fiican ayaa loo diiwaangeliyay, laakiin heerka molecular si liidata looma fahmin sida borotiinnadani ay ugu dhammaadaan hawlo badan oo bayooloji ah.Waxaan baarnay isdhexgalka borotiinka annagoo kalsooni sare leh oo ka dhexeeya ISG-yada la yaqaan.Waxa xiisaha lihi leh, waxaanu aqoonsannay shabakad ay ku jiraan MX1, USP18, ROBO1, OAS3, iyo STAT1 borotiinada kuwaas oo sameeya isku-dhafan weyn oo ka jawaabaya daaweynta IFNα (Jaantus 4, Shaxda S2) 32,33,34.Tan ugu muhiimsan, isdhexgalkaas waxaa laga helay dhammaan saddex-geesoodka lagu daaweeyay IFNa oo aan laga helin muunado aan la daweyn, taasoo soo jeedinaysa in si gaar ah loo sameeyay si looga jawaabo daaweynta IFNα.Waxaa la og yahay in STAT1 ay si qoraal ah u nidaamiso muujinta ISG-yadan, laakiin la macaamilka ISG-yada ee heerka borotiinka lama darsin.Qaab dhismeedka kristaalka ah ee STAT1 wuxuu muujiyay in domainkeeda helical (CCD) aysan ku lug lahayn isdhexgalka DNA ama protomers inta lagu jiro samaynta dimers35.Kuwan α-helices waxay sameeyaan qaab dhismeed helical ah kaas oo bixiya aagga dusha sare ee hydrophilic ee ugu badan ee isdhexgalka si uu u dhaco 35.Xogtayada CLMS, waxaan ku aragnay in badi isdhexgalka STAT1 ay ka dhaceen domainka SH2 ee ka horeeya CCD, domainka xiriiriyaha, ama dabada C-terminal (hadhaaga 700-708) (Jaantuska 4A).Daraasad hore ayaa sheegtay in USP18 ay ku xiran tahay CCD iyo DNA-binding domain (DBD) ee STAT2 waxaana loo qortaa qaybta I interferon receptor IFNAR2 si loo dhexdhexaadiyo xannibaadda nooca I interferon signaling 24.Xogtayadu waxay sidoo kale muujisay in USP18 catalytic domain ay la falgalaan STAT1 DBD (Jaantuska 4A,D), iyagoo soo jeedinaya in STAT1 iyo STAT2 labadaba laga yaabo inay door ka ciyaaraan soo jiidashada USP18 ilaa IFNAR2.
Shabakadda borotiinka-protein ISG ee lagu aqoonsaday unugyo isku-dhafan oo lagu daweeyey IFNa.(A) Sawirka is dhexgalka 2D oo muujinaya is dhexgalka borotiinka iyo borotiinka (oo laga soo saaray barnaamijka SIM-XL), oo leh xariiqyo matalaya isdhexgalka molecular (crosslink cutoff loo dhigay 3.5).Domains aqoonsiyo kala duwan waxaa lagu calaamadeeyay midabkooda32: MX1 domain, Dynamin_N (73-249), Dynamin_M (259-547), iyo GED (569-660).OAS3 domains: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), iyo OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678-758) iyo fn3 (777-864).Goobaha STAT1: STAT_int (2-120), STAT_alpha (143-309), STAT_bind (321-458), SH2 (573-657), iyo STAT1_TAZ2bind (715-739).(B) Daawada wareega ee borotiinnada isku-xiran (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, iyo STAT1) oo leh isdhexgal iyo isdhexgal lagu calaamadiyay buluug iyo casaan, siday u kala horreeyaan.Xadka isku-tallaabta ayaa lagu dejiyay 3.5.Dhibcuhu waxay muujinayaan goobaha isdhexgalka ee STAT1 ee leh MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), iyo OAS3 (F), iyo sidoo kale goobaha isdhexgalka ee K ama S ee u dhexeeya labada peptides.Jaantuska, heerka dhibcaha isku-tallaabta ayaa lagu dejiyay 3.0.(G) Goobo is-dhexgal oo kala duwan oo udhaxeeya STAT1 iyo OAS3 DI xayndaabyada oo dusha laga saaray qaab dhismeedka borotiinka ee PyMol (Nidaamka sawirada molecular PyMOL, nooca 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) iyo OAS3 (pdb id: 4s3n34).) barnaamijka.
Laba isoforms ee USP18 ayaa lagu sharaxay bini'aadamka, borotiinka dhererkiisu dhan yahay oo inta badan ku yaal xudunta, iyo isoform aan lahayn domain N-terminal, USP18-sf, kaas oo si siman loogu qaybiyay cytoplasm iyo nukleus 36.Intaa waxaa dheer, N-terminus ayaa la saadaaliyay inuu yahay mid aan qaabaysan oo uma baahna waxqabadka isopeptidase ama ISG1537 xidhitaanka.Inta badan isdhexgalka lagu aqoonsaday daraasaddeena waxay ku yaalaan N-terminus ee borotiinka, taas oo soo jeedinaysa in isdhexgalkani uu ku lug leeyahay USP18 oo buuxa (Jaantus 4A, D) oo sidaas awgeed waxay u badan tahay inay ku dhacaan xudunta.Waxaa intaa dheer, xogtayadu waxay sidoo kale tilmaamaysaa in N-terminus uu ku takhasusay isdhexgalka borotiinka-ilaa-protein.Goobta xiritaanka IFNAR2 waxay ku taallaa inta u dhaxaysa hadhaaga 312-368, iyo gaar ahaan, mid ka mid ah borotiinnada ku jira isku dhafan ee gobolkan (Jaantus. 4A) 37,38.Xogtan oo la isu geeyey ayaa tilmaamaysa in IFNAR2 xidhidhiyaha ay si gaar ah u isticmaalaan borotiinka soo-dhowaynta.Intaa waxaa dheer, kaliya OAS3 iyo ROBO1 ayaa la ogaaday inay la xiriiraan xayndaabka kor u kaca ee N-terminus iyo IFNAR2 goobta xidhitaanka (Jaantuska 4A).
ROBO1 waxa iska leh qoyska superfamily ee immunoglobulin (Ig) ee molecules signaling transmembrane waxayna ka kooban tahay shan Ig domains iyo saddex fibronectin (Fn) ee gobolka ka baxsan.Qaybahan ka baxsan unugga waxaa raacaya gobolka xuub-dhowrka iyo hal helix transmembrane ah 39. Gobolka intracellular aan habaysan wuxuu ku yaalaa C-terminus wuxuuna ka kooban yahay motifs taxane ah oo la ilaaliyo oo dhexdhexaadiya saameynta borotiinka 39.Gobolka ku fidsan amino acids ~ 1100 ilaa 1600 inta badan waa khalkhalsan yahay.Waxaan ogaanay in MX1 ay la falgasho ROBO1 iyada oo loo marayo Ig, Fn, iyo intracellular domains, halka inta badan isdhexgalka STAT1 ay ka dhacaan inta u dhaxaysa CCD, domain linker, iyo C-terminus ee ROBO1 (Jaantus 4A, E).Dhanka kale, isdhexgalka DI, DIII, iyo OAS3 gobollada isku xira ayaa loo qaybiyay dhammaan borotiinka ROBO1 (Jaantus. 4A).
Qoyska borotiinka oligoadenylate synthase (OAS) ayaa aqbala oo isku xidha intracellular double-stranded RNA (dsRNA), waxay maraysaa isbeddello qaabaysan, waxayna isku-dubbaridaa 2′,5′-linked oligoadenylates (2-5 As) 40.Waxaa la ogaaday in saddexda OAS, OAS3 ay soo bandhigto xiriirka ugu sarreeya ee dsRNA waxayna soo saartaa qadarka ugu yar ee 2-5 Sida, kaas oo kicin kara RNase L oo markaa xaddidaya taranka fayraska 41.Qoyska OAS waxa ay ka kooban yihiin polymerase beta (pol-β) -sida qaybaha wareejinta nucleotide.Cilmi-baaris hore ayaa muujisay in dhaqdhaqaaqa catalytic ee C-terminal domain (DIII) ay ku xiran tahay dsRNA-binding domain (DI), kaas oo looga baahan yahay firfircoonida OAS342.Waxaan aragnay in goobaha DI iyo DII ee OAS3 ay la falgalaan CCD iyo gobol yar oo isku xira SH2 iyo STAT1 TAD (Jaantuska 4A,F).Isku-dubbaridka goobo kala duwan oo isku-xiran oo ku saabsan qaab-dhismeedka borotiinka ayaa shaaca ka qaaday is-dhexgalka ka dhexeeya β-sheet iyo DBD STAT1 loop iyo jeebka furan ama dalool ay sameeyeen hadhaaga 60-75 ee qaybta DI ee OAS3 (Jaantus. 4G).Jihaynta borotiinnada ku jira dhismaha ayaa sidoo kale tilmaamay in midna isdhexgalka OAS3 uusan faragelin awoodda DNA-ku-xidhka ee domainkeeda DI (Sawir S1A).Intaa waxaa dheer, domainka N-terminal ee GTPase MX1 wuxuu si weyn ula falgalaa DI iyo DIII domains ee OAS3 (Jaantus. 4A).Waxaan sidoo kale aragnay isdhexgalka ka dhexeeya OAS1 iyo MX1 dhammaan saddexda IFNα-la daaweeyay, halkaas oo hal domain OAS1 (sidoo kale firfircooni firfircoon) uu la falgalay dhammaan saddexda MX1 (Jaantus S2A, B).
Borotiinnada MX waa qayb ka mid ah qoys weyn oo dynein u eg GTPases oo ka kooban domain N-terminal GTPase kaas oo xidha oo hydrolyzes GTP, qayb dhexe oo dhexdhexaadiya isu-ururinta, iyo jibbaar leucine C-terminal ah oo u shaqeeya sidii GTPase (LZ). ).domain effector domain25,43.MX1 waxay ku xidhan tahay qaybo ka mid ah polymerases fayraska si loo xakameeyo qoraalka hidda-wadaha fayraska43.Shaashadda khamiirka laba-isku-dhafan ee hore loo soo sheegay ayaa muujisay in PIAS1-ku-xiran MX1 ay joojiso firfircoonida hidda-wadaha STAT1-dhexdhexaadinta iyada oo xannibaysa waxqabadka DNA-ga oo sidoo kale leh SUMO E344,45 dhaqdhaqaaqa ligase.Halkan, waxaan ku muujineynaa in MX1 ay ku xiran tahay STAT1 (Jaantus 4C, D), si kastaba ha ahaatee sida isdhexgalkaani u saameeyaa STAT1-dhexdhexaadinta hidda-wadaha iyada oo laga jawaabayo IFNa waxay u baahan tahay daraasad dheeraad ah.Intaa waxaa dheer, waxaan sidoo kale ogaanay in MX1 ay la falgashay IFIT3 iyo DDX60 dhammaan saddexda IFNa-la daaweeyay (Sawir S2C).
DDX60 waa helicase cytoplasmic ah oo ay keentay IFN kaas oo hore loo soo sheegay inuu door ku leeyahay hoos u dhigista madax-bannaanida RIG-I ee fayraska RNA46.Waxay la falgashaa RIG-I waxayna ku hawlgelisaa calaamadeynteeda qaab ligand-gaar ah 46. DDX60 waxay ka kooban tahay DEXD / H-Box helicase domain iyo C-terminal helicase domain kaas oo xira fayraska RNA iyo DNA47.Inta badan isdhexgalka ay la leedahay MX1 iyo IFIT3 waxay ku dhacaan gobollada N-iyo C-terminal-ka dheer ee aan lahayn meelo canonical ama motifs (Jaantus. S2E, F).Si kastaba ha ahaatee, MX1 waxay sidoo kale la xiriirtaa DEXD/H-Box helicase domain (Sawir S2E).Borotiinnada qoyska IFIT waxay leeyihiin nuqullo tandem ah oo ah nooca helix-rogid-helix gaar ah oo loo yaqaan tetrapeptide repeat (TPR).IFIT3 waxaa lagu ogaadey inay tahay modulator togan ee calaamadeynta RIG-I oo markaa qayb ka ah dhismaha MAVS.Isku soo wada duuboo, xogtayadu waxay soo jeedinaysaa in IFIT3 iyo DDX60 ay ugu horrayn is dhexgalaan gobolka inta u dhaxaysa TPR 3-6 ee IFIT3 lagana yaabo inay door ka ciyaaraan calaamadaynta RIG-I/MAVS (Jaantus. S2F).
Marka la eego in baadhista borotiinka oo dhan uu xisaab ahaan aad u adag yahay, ka dib waxaanu baadhnay dhammaan xogta UniProt ee bini'aadamka joogitaanka mid ka mid ah soo noqnoqoshada IFNa-la daweeyay.Nuqulkan, waxaan ka helnay dhowr shabakadood oo is dhexgalka oo si heer sare ah loogu kalsoon yahay ee HLA-A.Falanqaynta dariiqyada borotiinka ee lagu aqoonsaday MS/MS spectra waxay muujisay in habaynta antigen-ku-salaysan ee MHC-I iyo soo bandhigida ay tahay dariiqa ugu muhiimsan ee ay keentay interferon (Jaantus. 3D).Sidaa darteed, waxaan diiradda saarnay inaan barano isdhexgalka borotiinka ee MHC-I molecules oo leh kalsooni heer sare ah oo lagu qabo dhammaan shaybaarrada isku-xiran.HLA waxay ka kooban tahay α1, α2 iyo α3 xayndaabyada iyo silsiladaha iftiinka, iyo microglobulin β2 (β2m) waa borotiinka chaperone joogto ah49.Marka la isugu keeno xuubka endoplasmic reticulum, HLA waa mid aan degganayn maqnaanshaha peptide ligands50.Qodabka peptide-ku xidha waxaa sameeyay xayndaabyada aadka u sarreeya iyo α1 iyo α2 ee aan habaysanayn ee qaabka aan peptide ahayn iyo qaybta α351 ee polymorphic ka yar.Joogitaanka IFNα, waxaan ogaanay laba kabood oo HLA-A ah: mid wuxuu la falgalaa HMGA1 iyo H2B (Jaantuska 5, Shaxda S3) kan kalena wuxuu la falgalaa MDN1, LRCH4 iyo H2B (Jaantuska 6).
IFNα waxay kicisaa shabakad is dhexgalka HLA-A oo leh H2B (H2BFS) iyo HMGA1.(A) Sawirka 2D (oo lagu soo saaray software-ka SIM-XL) oo muujinaya noocyada kala duwan ee isdhexgalka ee dhismaha H2B-HLA-A-HMGA1: interlink (buluug), interlink (casaan) iyo hal xiriiriye (madow)..Domains aqoonsiyo kala duwan waa midab kood 32: H2B (histone; 2-102) iyo MHC-I (MHC_1; 25-203, kooxda C1; 210-290 iyo MHC_I_C; 337-364).Xadka isku-tallaabta ayaa lagu dejiyay 3.5.Dhibcaha dhibcuhu waxay muujinayaan goobaha is dhexgalka HLA-A ee H2B (B) iyo HMGA1 (C), iyo sidoo kale goobaha isdhexgalka K ama S ee u dhexeeya labada peptides.Jaantuska, heerka dhibcaha isku-tallaabta ayaa lagu dejiyay 3.0.(D) Xidhiidhka ka dhexeeya borotiinnada lagu muujiyey qaab-dhismeedka borotiinnada H2B, HLA-A, iyo HMGA1 ee barnaamijka PyMOL.Qaab dhismeedkan waxaa loo qaabeeyey iyadoo la adeegsanayo server-ka Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) iyo qaab-dhismeedka qaab-dhismeedka borotiinnada H2B, HLA-A iyo HMGA1 waxay ahaayeen 1kx552, 1kj349 iyo 2eze55, siday u kala horreeyaan.
IFNα waxay kicisaa shabakad is dhexgalka HLA-A oo leh H2B (H2BFS), MDN1 iyo LRCH4.(A) Intramolecular (cas) iyo intermolecular (buluug) oo lagu soo bandhigay khariidad is dhexgal ah oo 2D ah (oo laga soo saaray software-ka SIM-XL) oo leh MDN1 oo u taagan goobaabin ahaan.Xadka isku-tallaabta ayaa lagu dejiyay 3.5.Domains aqoonsiyo kala duwan waa midab kood32: H2B (histone; 2-102), MHC-I (MHC_1; 25-203, kooxda C1; 210-290 iyo MHC_I_C; 337-364) iyo LRCH4 (LRR_8 (68-126), LRR_8 (137-194) iyo CH (535-641)).(B) Xidhiidhka ka dhexeeya borotiinnada lagu muujiyey qaab-dhismeedka borotiinnada H2B, HLA-A, LRCH4, iyo MDN1 ee barnaamijka PyMOL.Qaab dhismeedkan waxaa loo qaabeeyey iyadoo la adeegsanayo server-ka Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) oo leh qaab-dhismeedka qaab-dhismeedka 1kx552, 1kj349, 6hlu62 iyo 6i2665 ee H2B, HLA-A, LRCH4 iyo MDN1 borotiinnada, siday u kala horreeyaan.Sawirro dhibco ah oo muujinaya goobaha is dhexgalka K ama S ee HLA-A ee leh H2B (C), LRCH4 (D), iyo MDN1 (E).Goobaha, heerka dhibcaha isku-tallaabta ayaa loo dejiyay 3.0.
Marka lagu daro ilaalinta daacadnimada genome-ka, histone H2B ayaa sidoo kale ku lug leh nidaaminta qoraalka.borotiinka H2B wuxuu ka kooban yahay barta dhexe ee histone domain (HFD) oo ay sameeyeen saddex α-helices oo ay kala soocaan siddo iyo dabada C-terminal 41,52.Inta badan isdhexgalka H2B wuxuu ku dhacaa α1 helix, kaas oo bixiya trimerization HFD heterodimer (Jaantus. 5A, B).Inkasta oo lysinsku ay ku lug leeyihiin isku-xidhka DNA-da, qaar ka mid ah lysins sidoo kale waa goobo kale oo acetylation ama methylation.Tusaale ahaan, hadhaaga K43, K46, iyo K57 ee H2B kuma jiraan xidhidh DNA oo toos ah, laakiin waa bartilmaameedyo kala duwan oo wax ka beddelka qoraalka ka dambeeya53.Sidoo kale, hadhaaga K44, K47, iyo K57 ee H2B ayaa laga yaabaa inay door kale ka ciyaaraan joogitaanka IFNα, oo ay ku jiraan isdhexgalka borotiinnada kale (Jaantus. 5A, B).Intaa waxaa dheer, histone-ka extrachromosomal H2B wuxuu kiciyaa jawaabta difaaca ee noocyada unugyada kala duwan, isagoo u dhaqma sidii dareeme cytosolic si loo ogaado jajabyada DNA-da laba-geesoodka ah (dsDNA) ee ka soo jeeda wakiilada faafa ama unugyada dhaawacan54.Marka ay joogaan fayrasyada DNA-da, dhimista H2B waxay joojisay wax soo saarka IFN-β iyo STAT154 fosforyaalka.H2B sidoo kale waxaa loo yaqaanaa inay u guurto oo uga baxdo xudunta si ka dhakhso badan histones kale ee asaasiga ah54.Isdhexgalka H2B ee MDN1 iyo LRCH4 ayaa sidoo kale lagu arkay muunado aan la daweyn oo la doortay.Waxaan ogaanay in HLA-A ay la falgashay H2B dhammaan saddexda muunado ee IFNα-daaweeyay iyo hal muunad oo aan la daawayn ku celin.Xogtaasi waxay ka tarjumaysaa doorka H2B ee hawl kale oo jireed oo ka madax bannaan xeerar qoraal ah.
HMGA1 (kooxda dhaqdhaqaaqa sare AT-Hook 1), oo ah nukleoprotein yar oo qani ku ah asiidhyada amino-ka kor u qaada cudurada, ayaa lagu aqoonsaday iyadoo lala kaashanayo HLA-A.Waxay leedahay dabada C-terminal acidic iyo saddex DBD oo kala duwan oo loo yaqaan AT hooks sababtoo ah waxay ku xidhaan jeexdin yar ee gobolka AT-hodanka ah ee dsDNA55,56.Ku-xidhkaani wuxuu keenaa in DNA-da uu leexiyo ama tooso, taasoo u oggolaanaysa qodobbada qoraalka canonical si ay u helaan isku xigxiga la isku raacsan yahay.Dabada C-terminal ayaa la rumeysan yahay inay ku lug leedahay isdhexgalka borotiinka-barootiinka iyo qorista arrimaha qoraalka, maadaama C-terminal tirtiridda mutants aysan awoodin inay bilaabaan qoraal-qoraal57.Waxaa intaa dheer, goobtan waxay ka kooban tahay dhowr goobood oo fosforyaal ah oo la ilaaliyo kuwaas oo loo yaqaan substrates for kinase 58 .Waxaan aragnay isdhexgalka HLA-A iyo H2B ee HMGA1 ka baxsan goobta C-terminal, taasoo soo jeedinaysa in goobta C-terminal inta badan loo isticmaalo xidhitaanka qodobka qoraalka (Jaantus. 5A, C).Barootiinada HMGA waxay la tartamaan histone H1 si loogu xidho adabtarada DNA-da, taasoo kordhinaysa helitaanka57.Sidoo kale, waxay u muuqataa inay u badan tahay in HMGA ay la falgasho histone H2B oo ay weheliso xiriiriyaha DNA ee tartanka histone H1.HMGB1 waxay kicisaa muujinta HLA-A, -B, iyo -C ee unugyada dendritic, taasoo horseedaysa firfircoonidooda59, laakiin isdhexgalka ka dhexeeya HMG iyo HLA hore looma soo sheegin.Waxaan ogaanay in HMGA1 ay la falgasho qaybaha α1 iyo α3 ee HLA-A, iyada oo inta badan isdhexgalka ka baxsan 3 DBD (Jaantus 5A,C).Gacmaheena, HLA-A waxaa lagu ogaadey in lagu meeleeyay xudunta (xogta aan la muujin), oo la siiyay in H2B iyo HMGA1 ay sidoo kale ku jiraan xudunta, isdhexgalkaani wuxuu u badan yahay inuu ku dhaco xudunta.Meelo gaar ah oo lagu cabiray inta u dhaxaysa H2B, HLA-A, iyo HMGA1 ayaa lagu muujiyay sawirka 5D.
Inta badan isdhexgalka HLA-A ee borotiinnada kale waxay ka dhacaan gudaha xayndaabkeeda α1 iyo α2 iyo qaybta C-terminal-ka ee khalkhalsan (Jaantus. 6).Mid ka mid ah tusaalooyinkan, waxaan ku ogaanay in HLA-A ay la falgasho dabada N-terminal ee LRCH4 (Jaantuska 6A,D).LRCH4 waxay xakameysaa firfircoonida TLR4 iyo soo-saarka cytokine LPS, taas oo wax ka beddelaysa jawaabta difaaca gudaha60,61.Waa borotiinka xuubka leh oo leh sagaal leucine oo qani ku ah soo noqnoqda (LRRs) iyo calmodulin (CH) homology motif ee ectodomainkeeda, oo ay ku xigto domain transmembrane (TMD) 60, 62.Goobaha CH ayaa lagu soo warramey inay dhexdhexaadiyaan isdhexgalka borotiinka-protein 60.Fiirin qiyaastii 300 oo acids amino ah oo udhaxeeya xayndaabka LRR iyo CH waa wax la heli karo laakiin khalkhalsan.Iyada oo ku saleysan shaqada gobollada khalkhalka sida dhexdhexaadiyeyaasha shabakadaha borotiinka-protein-ka iyo gaadiidka vesicular 63, waxaan ogaanay in isdhexgalka borotiinka badankood uu ka dhaco gobollada khalkhalka leh.Isdhexgalka MDN1 ayaa loo qaybiyay inta uu dhan yahay borotiinka, oo ay ku jiraan LRR1, LRR6, CH domains, iyo gobollada random, halka H2B ay inta badan ku xiran tahay qaybta CH (Jaantus. 6A, B).Waxaa xusid mudan, midna is dhexgalka kuma jiro TMJ, isagoo soo jeedinaya gaar ahaan habka CLMS (Jaantuska 6A, B).
MDN1 ayaa sidoo kale loo aqoonsaday inay tahay qayb ka mid ah shabakada borotiinka HLA-A (Jaantuska 6A).Waxay ka tirsan tahay qoyska AAA ee borotiinnada (ATPases la xidhiidha hawlo kala duwan).Kani waa isla N-terminal AAA oo isku habeeya giraanta hexameric oo ka saarta qodobka isku-xidhka qaybta 60S 64 ribosomal.waxay u muuqataa inay la mid tahay dynein64,65,66.Intaa waxaa dheer, gobolka qani ku ah Asp/Glu waxa raacaya qaybta MIDAS (goobta ku xidhan birta).Sababtoo ah cabbirka weyn ee MDN1 (qiyaastii 5600 amino acids) iyo homology xaddidan oo leh borotiinno si wanaagsan loo bartay, wax yar ayaa laga yaqaan qaab-dhismeedkeeda iyo shaqada aadanaha.Waxaan u aqoonsanay HLA-A, H2B, iyo LRCH4 inay yihiin la-hawlgalayaal isku xidhan oo MDN1 ah waxaanan shaaca ka qaaday hanuunintooda sida dhismooyinka borotiinka ee PyMol (Jaantus. 6A,B).Saddexdan borotiino waxay la falgalaan aagga AAA, domain-ku-xidhaha dynein-la midka ah, iyo suurtogalnimada bogga MIDAS MDN1.Warbixintii hore, nadiifinta isku xidhnaanta borotiinnada sed waxay MDN1 u aqoonsatay borotiin la xidhiidha histone H2B67.Intaa waxaa dheer, daraasad dhowaan la sameeyay ayaa sidoo kale sheegtay isdhexgalka ka dhexeeya MDN iyo HLA-B ee unugyada HCT116 iyadoo la adeegsanayo spectrometry mass spectrometry-la safeeyey, taageeraya natiijooyinkayada68.Aqoonsiga kakan kakan ee muunado la daweeyay IFNa ayaa soo jeedinaya doorka MDN1 ee calaamadinta interferon.
Sababtoo ah hiddo-wadaha HLA waa polymorphic aad u sarreeya, waxaanu ka soo saarnay taxanaha akhrinta khariidaynta HLA-A, -B, iyo -C ee xogta taxanaha RNA ee unugyada Flo-1 (xogta aan la muujin).Taxanayaasha Peptide ee la socda akhrinta isku xigxiga ayaa muujiyay farqi weyn oo u dhexeeya HLA-A, -B, iyo -C ee gobolada ay ku yaalaan peptides-ka-xiran ee HLA-A (Jaantuska S3).Intaa waxaa dheer, ma aanaan dhawrin isku xidhka borotiinka-barootiinka ee unugyada HLA-B/C ee leh borotiinnada H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Tani waxay soo jeedinaysaa in isdhexgalka borotiinka laga helay HLA-A, MDN1, LRCH1 iyo HMGA1 uu yahay HLA-A gaar ah.Intaa waxaa dheer, falanqaynta borotiinka ee muunado aan isku xidhnayn (Shaxda S4) ayaa muujisay in HLA-A ay leedahay caymis badan oo isku xiga marka la barbar dhigo HLA-B ama HLA-C.peptides-ka loo aqoonsaday HLA-A waxay ahaayeen kuwo aad u sarreeya labadaba IFNα-la daweeyay iyo muunadaha aan la daweyn.
Si loo hubiyo in isdhexgalka halkan lagu aqoonsaday aanay sabab u ahayn isku xidhka aan khaaska ahayn ee isku xidhka laba borotiino ee u dhow dhow, waxaanu sii xaqiijinay laba arrimood oo is dhexgal ah oo HLA-A ah annagoo samaynayna qiimayno is-difaac-ilaaliye ah.HLA-A isdhexgalka MDN1 endogenous iyo H2B ayaa lagu ogaaday labadaba IFNα-la daaweeyay iyo unugyada Flo-1 ee aan la daweyn (Jaantuska 7, Jaantuska S4).Waxaan xaqiijinay in HLA-A lagu qabtay H2B ee difaaca jirka iyo in ururkan ay sabab u tahay daawaynta IFNα tan iyo markii HLA-A ay ka maqan tahay shaybaarada difaaca jirka ee unugyada aan la daweyn (Jaantuska 7A).Si kastaba ha ahaatee, xogtayadu waxay soo jeedinaysaa in IFNa ay si kala duwan u maamusho HLA-A ku xidhitaanka H2B iyo MDN1.IFNα waxay kicisaa xidhiidhka ka dhexeeya H2B iyo HLA-A, laakiin waxay yaraynaysaa xidhiidhka ay la leedahay MDN1.Waxaan ogaanay in MDN1 ay la xiriirto HLA-A ee kontaroolada, iyo ku darida IFNa waxay hoos u dhigtay isdhexgalkan ka madaxbannaan MDN1 soo-gelinta IFNα (Jaantus 7B, C).Intaa waxaa dheer, HLA-A immunoprecipitation H2B ee unugyada A549 (Jaantus. S4), oo soo jeedinaya in isdhexgalka tani ay ka madax banaan tahay nooca unugyada.Isku soo wada duuboo, natiijooyinkani waxay taageerayaan isdhexgalka dhexdhexaadinta interferon-ka ee HLA-A iyo H2B iyo MDN1.
HLA-A waxay wada nadiifisaa H2B iyo MDN1.Wakiilada endogenous H2B (A) iyo MDN1 (B) immunoblots ayaa laga difaacay IFNa-daaweeyay unugyada Flo-1 waxaana laga baaray unugyada difaaca ee la tilmaamay.Jiirka iyo bakaylaha IgG ayaa loo adeegsaday xakameyn xun.(C) Qaddarka qaraabada ah ee antigen-yada kala duwan ayaa lagu muujiyay immunoblots oo laga baaray unugyada difaaca jirka ee la tilmaamay, β-actin ayaa loo isticmaalay xakameynta rarida.
Sifooyinka qaab dhismeedka mid ka mid ah shabakadaha interferon-ka ee ay keentay shabakado isku xidhan oo aad laysku halayn karo, H2B-HLA-A-HMGA1, ayaa la baadhay.Waxaan u isticmaalnay qaabaynta dhaq-dhaqaaqa molecular qaab beddelka ah si aan u fahanno dhaqdhaqaaqyada iswaafajinta ee borotiinnada ku lug leh kakan (Jaantuska 8).Natiijooyinka laga soo xigtay xogta CLMS waxay soo jeedinayaan suurtagalnimada is-waafajinta kala duwan ee borotiinnada H2B, HLA-A, iyo HMGA1.Sidaa darteed, dhismooyinka soo socda ee suurtagalka ah ayaa lagu qaabeeyey dhexdhexaad dhexdhexaad ah: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, iyo H2B-HLA-A-HMGA1.Shaashadda xidhitaanka borotiinka-protein-ka ee bilowga ah iyadoo la adeegsanayo MOE (Molecular Operating Environment; Kiimikada Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) waxay soo jeedisay jaangooyooyin suurtagal ah oo ka duwan borotiinnadan (Jaantus. 8A).Aragtida dhismaha borotiinka xidhitaanka ayaa muujisay dhawr is dhexgal iyo is-waafajin suurtagal ah (Jaantuska 5A, 8).Haddaba, hal is-waafajin oo suurtogal ah ayaa lagu muujiyey Jaantuska 8A (oo leh calaamado iskutallaabta ah) waxaana lagu sii qiimeeyay iyada oo la adeegsanayo dhuumaha qaabaynta MD.Intaa waxaa dheer, ku-xidhka H2B ama HMGA1 ee HLA-A waxay muujinaysaa xidhiidhka sare ee H2B ee HLA-A (Jaantus. 8A).
Dhaqdhaqaaqa is-beddelka ee shabakadaha suurtogalka ah ee u dhexeeya dhismayaasha H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A, iyo H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Gudida bidix waa khariidad 2D ah (oo lagu soo saaray software-ka SIM-XL)Intaa waxaa dheer, hadhaaga isku-xiran ee la aqoonsaday ayaa lagu calaamadeeyay qaab-dhismeedka borotiinnada H2B, HLA-A, iyo HMGA1.Qaababka la xidhiidha borotiinadan ayaa la soo saaray iyadoo la adeegsanayo dhuumaha xidhitaanka ee lagu hirgeliyay xirmada MOE.Qaybta bidix ee hoose waxay tusinaysaa is-waafajinta suurtagalka ah ee kala duwan ee H2B-HLA-A iyo HMGA1-HLA-A oo leh xidhidhyo xidhidhyo borotiin-protein kala duwan (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Isbeddelka caadiga ah (RMSD) ee boosaska atamka (marka laga reebo atamka hydrogen) ee qaabdhismeedka borotiinka kasta.(C) Isdhexgalka borotiinka-borootiinka hydrogen-ka isdhexgalka ee ka yimaada dhismayaal la ekaysiiyay oo kala duwan iyadoo la tixgelinayo isdhexgalka gaarka ah ee muddada ≥ 10 ns.Masaafada goynta ku-deeqaha-qabtaha-h-bond waxa lagu dejiyay 3.5 Å, iyo ku-deeqaha-H-aqbalaha xagal goynta waxa la dejiyay ≥ 160°-180°.(D) Hadhaaga calaamadeysan ee samaynta is dhexgalka borotiinka-protein-ka HLA-A ee la-hawlgalayaashooda, dhereran ≥ 20 ns, oo laga soo saaray dhismooyinka HLA-A-H2B iyo HLA-A-HMGA1.Qaab dhismeedka borotiinku waxay u taagan yihiin qaabdhismeedka celceliska 100 ns MDS.(E) Isdhexgalka ka dhexeeya dhismayaasha HLA-A-H2B iyo HLA-A-HMGA1 marka la barbar dhigo isdhexgalka ay raadraaceen jilitaanka H2B-HLA ee ka badan 100 ns oo ku salaysan goobta is dhexgalka K ama S ee u dhexeeya labada peptides.Complexes /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Qiimaha bilowga ee qiimaynta isku-tallaabta ayaa loo dejiyay 3.0, iyo isdhexgalka gaarka ah ee ka yimid MDS qaadashada ≥ 10 ns ayaa la tixgaliyay.Qaab dhismeedka borotiinka waxaa lagu sawiray iyadoo la adeegsanayo BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) iyo Baakadaha Hawlaha Molecular (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).
Xasiloonida molecules HLA-A waqti ka dib (isbedelka caadiga ah; RMSD ama weecanaanta caadiga ah; RMSF) waxay muujisay in joogitaanka borotiinnada H2B ama HMGA1 ee ka kooban yahay ay xasiliyeen HLA-A (Jaantuska 8B, Jaantuska S5).Barootiinka HMGA1 wuxuu si adag ugu xidhan yahay goobta B2M ee HLA-A, taasoo keenaysa xasiloonida asiidhyada amino-ga ee HLA-A-HMGA1 ama H2B-HLA-A-HMGA1 (Jaantuska 8B, Jaantuska S5).gaar ahaan, hadhaaga HLA ~ 60-90 iyo ~ 180-210 ayaa la ogaaday inay ka dabacsan yihiin joogitaanka H2B (FIG. 8B).H2B iyo HMGA1 waxay muujiyeen ku xidhnaanta HLA-A ee dhismaha H2B-HLA-A-HMGA1 marka la barbar dhigo HLA-A ku xidhida H2B ama HMGA1 oo keliya (Jaantuska 8C,D; Shaxda S5).Hadhaaga ku lug leh isku xidhka hydrogen (MD qaabaysan degenaansho sare ≥ 10 ns) waxay ku beegan tahay goobaha is dhexgalka CLMS (K ama S hadhaaga) ee kakan, taasoo soo jeedinaysa in isdhexgalka ay aqoonsatay CLMS ay tahay mid la isku halayn karo.Kalsoonida (Jaantus. 8E).Qaabaynta CLMS iyo MD, hadhaaga HLA-A inta u dhaxaysa 190-210 iyo ilaa 200-220 amino acids ayaa laga helay inay xidhaan H2B iyo HMGA1, siday u kala horreeyaan (FIG. 8E).
Is dhexgalka borotiinka iyo borotiinku waxay sameeyaan shabakado dhismeed firfircoon oo dhexdhexaadiya isgaadhsiinta unugyada si ay uga jawaabaan kicinta qaarkood.Sababtoo ah habab badan oo borotiinka ah ayaa ogaanaya isbeddelada heerka guud ee joogtada ah ee borotiinka, firfircoonida isdhexgalka borotiinka-proteinku waxay u baahan yihiin qalab dheeraad ah si ay u qabtaan isku xidhka isku xidhka, iyo CLMS waa mid ka mid ah qalabkan.Nidaamka calaamadaynta interferon waa shabakad cytokine ah oo u oggolaanaysa unugyadu inay ka jawaabaan noocyo kala duwan oo ah calaamadaha cudur-sidaha deegaanka iyo kuwa gudaha ah, oo ku dhammaanaya soo-saarka qaybo-hoosaadyo borotiinno-inducible interferon.Waxaan codsanay CLMS si aan u go'aamino haddii isdhexgalka borotiinka iyo borotiinka laga dhex aqoonsan karo guddi borotiinada interferon-ku-abuuray.Falanqaynta isku-xidhka borotiinka caalamiga ah ee qaabka interferon-ka jawaabaya qaabka unugga Flo-1 ayaa loo isticmaalay in lagu qabto dhismooyinka borotiinka.Ka-soo-saarka peptides-ka tryptic-ka ee unugyada aan isku-tallaabta ahayn iyo kuwa isku-dhafan waxay u oggolaanayaan tirinta peptide-ka, kobcinta dariiqa, iyo qaybinta dhererka peptide ee qeexan xoojinta LFQ.Borotiinnada interferon-ku-soo-baxa ee Canonical ayaa loo aqoonsaday inay yihiin xakameyn gudaha ah oo togan, halka isku-dhafan cusub oo isku-dhafan oo isku-dhafan oo isku-dhafan oo isku-dhafan oo ka mid ah borotiinnada interferon-ka-soo-baxa sida MX1, UP18, OAS3 iyo STAT1 la arkay.Sifooyin dhismeed oo kala duwan iyo is-dhexgalka meelaha shaqada ayaa la baaray.
Is dhexgalka u dhexeeya HLA-A, MDN1 iyo H2B ayaa lagu ogaadey difaac difaac ee unugyada Flo-1 iyo A549 oo lagu daweeyey oo aan lagu daawayn IFNa.Natiijooyinkayagu waxay muujinayaan in HLA-A ay ka kooban tahay H2B qaab ku tiirsan IFNa.Shaqadayadu waxay ka dhigan tahay waddo xiiso leh oo loogu talagalay sahaminta dheeraadka ah ee isku-dubbaridka labadan dhisme.Waxa kale oo ay noqon doontaa mid xiiso leh in la ballaariyo habka CLMS ee guddi ka mid ah xariiqyada unugyada si loo aqoonsado isdhexgalka borotiinka dhexdhexaadka ah ee-nooca-unugga-madax banaan.Ugu dambeyntii, waxaan u isticmaalnay qaabeynta MD qaab beddelaad ah si aan u fahamno dhaqdhaqaaqa isbedbeddelka ee borotiinnada ee ku lug leh isku-dhafka H2BFS-HLA-A-HMGA1, kaas oo raadraaca wada-hadallada is-dhaafsiga ee molecular iyo intermolecular.Natiijooyinka laga soo xigtay xogta CLMS waxay soo jeedinayaan suurtogalnimada is-waafajinta kala duwan ee borotiinnada H2BFS, HLA-A, iyo HMGA1.Is-waafajinta kala duwan ee suurtogalka ah ee udhaxeeya dhismooyinka borotiinka soo xirida ayaa muujiyay dhowr isdhexgal oo la mid ah kuwa lagu arkay xogta CLMS.Mid ka mid ah awoodaha ugu muhiimsan ee habkeena ayaa ah in ay ogolaato in si fudud loo aqoonsado isdhexgalka hiddo-wadaha aadka u sarreeya sida HLA, markaa waxay noqon doontaa mid xiiso leh in la barto isdhexgalka borotiinnada gaarka ah ee HLA haplotype kuwaas oo haddii kale ay adag tahay in la barto.Isku soo wada duuboo, xogtayadu waxay muujinaysaa in CLMS loo isticmaali karo si loo balaadhiyo fahamkayaga shabakadaha calaamadaha interferon-ka iyo bixinta aasaaska barashada hababka intercellular ee kakan ee buro microenvironment.
Unugyada Flo-1 ayaa laga helay ATCC waxaana lagu ilaaliyay DMEM (Gibco) oo lagu kabay 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen), 10% serum bovine bovine (Gibco) oo uurjiif ah oo lagu kaydiyay 37 ° C iyo 5% CO2.KordhintaUnugyada ayaa la koray ilaa 70-80% isku darka ka hor inta aan lagu daawayn IFNα14 (waxaa soo saartay Xarunta Wax soo saarka Protein ee Edinburgh).Dhammaan kiimikooyinka kale iyo reagents waxaa laga soo iibsaday Sigma Aldrich ilaa si kale loo xuso.
Unugyada Flo-1 waxaa lagu dhaqay taarikada 6-ceel maalinta xigtana unugyada waxaa lagu daaweeyay 10 ng/ml IFNα14 saacadaha 24 ilaa qiyaastii 80% isku dhafka.Unugyada waxaa lagu maydhay saddex jeer PBS waxaana lagu xidhay DSS oo dhowaan la diyaariyey (Thermo Fisher Scientific) (oo lagu milmay DMSO) gudaha PBS 5 min ee 37 ° C. ilaa ugu dambeyntii 0.5 mM.falcelinta isku xidhka DSS waxa lagu bedelay PBS hadhaaga DSS waxa la demiyay iyadoo lagu daray 20mM Tris (pH 8.0) gudaha PBS 15 min at 37°C.Unugyada waxaa lagu soo ururiyay xoqid waxaana lagu soo ururiyay tuubooyinka xidhitaanka hooseeya (Axygen).
Pellet-ka unugga waxaa lagu shubay 300 µl oo ah kaydka urea lysis (8 M urea, 0.1 M Tris, pH 8.5) ilaa 30 min heerkulka qolka iyadoo la ruxmayo marmar.Dhammaan tillaabooyinka centrifugation waxaa lagu sameeyay 14,000 xg at 8°C.Cenrifuge lysate ilaa 10 daqiiqo oo ku wareeji supernatant tube cusub.Qaybaha cad ee soo hadhay ayaa lagu milmay 150 μl ee kaydiyaha labaad ee lysis (2 M urea, 2% (w / v) SDS (sodium dodecyl sulfate)) 30 daqiiqo ama ka badan ilaa laga helayo xal aqueous isku mid ah.lysate-ka ayaa la isku daray 20 daqiiqo, ka sarreeyana waxaa lagu qasi jiray lysate ee laga helay tallaabadii hore.Heerarka borotiinka waxaa lagu qiimeeyay iyadoo la adeegsanayo baaritaanka Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) iyadoo loo eegayo tilmaamaha soo saaraha ee hababka microplate.Tijaabooyinku si dhakhso ah ayaa loo qaboojiyey iyadoo lagu jiro nitrogen dareere ah waxaana lagu kaydiyey -80 ° C.
Ku dhawaad ​​100 μg ee borotiinka isku-dhafan ee milmay ayaa lagu farsameeyay iyadoo la adeegsanayo hab-raaca diyaarinta muunadda sifaynta ee la beddelay (FASP) sida ay ku qeexeen Wisniewski et al.69 Si kooban, borotiinku waxa uu ku xidhan yahay 200 µl oo ah kaydka urea (8 M HOL ee 0.1 M Tris, pH 8.5), la rogay oo kala badh la jaray.Dhammaan tillaabooyinka centrifugation waxaa lagu sameeyay 14,000 xg at 25°C.Qaybtii hore ee borotiinka lysate-ku-xidhiidhka ah ayaa loo wareejiyay 10 kDa Microcon centrifugal qalab filter oo ku qalabaysan xuubka Ultracel-10 (Merck), oo ay ku xigto centrifugation shaandhada 25 daqiiqo.Ka dib ku dar qaybta labaad ee borotiinka shaandhada oo ku celi tillaabooyinka isku midka ah.Soo kabashada borotiinka waxaa lagu sameeyay iyadoo lagu daray 100 μl ee 17 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) ee kaydka urea.Soo kabashada ayaa lagu walaaqay heerkulbeeye 600 rpm 30 daqiiqo at 37°C.Intaa waxaa dheer, tiirku wuxuu ahaa centrifuge iyo borotiinka iskutallaabta ee la dhimay ayaa la alkylated iyadoo la isticmaalayo 100 μl ee 50 mM iodoacetamide ee kaydinta urea.Dareen-celinta alkylation-ka waxaa lagu sameeyay heerkulka qolka 20 daqiiqo gudcurka.Ku wareeji tiirka, ku dhaq darbiyada tiirarka 3 jeer 100 µl urea kayd, ka dibna sentrifuge.Qalliin isku mid ah ayaa la sameeyay 3 jeer iyadoo la adeegsanayo 100 μl oo 100 mM ammonium bicarbonate ah.Kahor trypsinization-ka, ku beddel tuubada aruurinta mid cusub.Ku dar bakhaar dheefshiidka ka kooban 50 mM ammonium bicarbonate iyo 1 µl trypsin oo lagu qasi jiray bakhaarka trypsin (Promega).Saamiga trypsin-ka iyo borotiinka ayaa la dhawray abbaaraha 1:33, fal-celinta dheef-shiid kiimikaadkana waxaa lagu duray habeenkii 37° C. qol qoyan.Peptide-ka isku-tallaabta ayaa laga saaray shaandhada iyadoo la saaray centrifugation ilaa 25 daqiiqo.Soo kabashada Peptide ayaa la hagaajiyay iyadoo lagu daray 50 μl oo 0.5 M NaCl ah shaandhada, oo ay ku xigto centrifugation 25 daqiiqo.
Tiirarka C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) ayaa loo isticmaalay in lagu nadiifiyo peptides-ka isku-xiran ee isku-xiran ee isku-dhafan iyadoo la raacayo borotokoolka lagu sharraxay Bouchal et al.70 oo leh isbeddello yaryar.Si kooban, tiirarka lafdhabarta ee C18 ayaa lagu hawlgeliyay saddex dhaqid oo ah 0.1% formic acid (FA) ee acetonitrile (AcN) (Merck) iyo laba dhaqid oo ah 0.1% FA.Tiirka waxaa lagu fuuqeeyay 0.1% FA 15 daqiiqo.Ku shub shaybaarada tiirarka lafdhabarta oo ku dhaq 3 jeer 0.1% FA.Peptides-ka la macmalay ayaa si isdaba joog ah loogu xalliyay jaangooyo tartiib tartiib ah iyadoo la adeegsanayo 50%, 80% iyo 100% AcN gudaha 0.1% FA.Tijaabooyinku waxa lagu qallajiyey xawaaraha SpeedVac Plus (Eppendorf) ilaa dareeraha haraaga ahi gebi ahaanba meesha ka baxo.peptides-ka sare loo qaaday ayaa lagu milmay 100 μl oo ah 0.08% trifluoroacetic acid gudaha 2.5% AcN iyo uruurinta waxaa lagu cabiray NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Qiyaastii 1 μg ee peptide-ka isdhaafsan ee muunad kasta ayaa lagu duray nidaamka LC-MS/MS.
peptides-ku-xiran-ku-xiran ayaa lagu kala saaray nidaamka UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) oo ku xiran Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific).peptides-ku-xiran oo isku-tallaaban ayaa lagu soo ururiyay aqoonsi 300 µm ah, 5 mm dheer µ-column C18 tiir qabasho oo ay ka buuxaan C18 PepMap100 sorbent iyo 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Ku shub qulqulka bamka ee la dhigay 5 µl/min 0.08% trifluoroacetic acid oo lagu milmay 2.5% AcN.peptides-isku-xiran ayaa lagu kala soocay tiir silica isku dhafan oo falanqeyn leh oo leh dhexroor gudaha ah 75 μm iyo dhererka 150 mm, oo ay ka buuxaan 2 μm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Wajiyada mobilada A iyo B waxay ka koobnaayeen 0.1% FA biyaha iyo 0.1% FA ee acetonitrile, siday u kala horreeyaan.Jaangooyuhu wuxuu ka bilaabmaa 2.5% B wuxuuna si toos ah u kordhaa ilaa 40% B 90 daqiiqo, ka dibna 90% B 2da daqiiqo ee soo socota.Halabuurka wejiga wareega ayaa lagu ilaalinayay 90% B 10 daqiiqo ka dibna si toos ah ayaa hoos loogu dhigay 2.5% B 2 daqiiqo gudahood.Tiirka waxaa lagu miisaamay 2.5% B 8 daqiiqo kahor wareegga xiga.peptides-ku-xiran oo ka soo baxay tiirka gorfaynta ayaa laga saaray isha nanoelectrospray ionization (NSI) waxaana lagu duray Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific).
Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer wuxuu ku shaqeeyaa habka saxda ah ee isku xidhka xogta.Sawir buuxa ayaa lagu sameeyay qaabka qaybta iyadoo la eegayo 120,000 oo leh goobo kala duwan oo m/z 350 Th ilaa m/z 2000 Th.Bartilmaameedka caadiga ah ee AGC ayaa lagu dejiyay 300% iyada oo wakhtiga ugu badnaan la soo gelinayo 50ms.Ogaanshaha ugu sarreeya ee monoisotopic ayaa loo sameeyay peptides.Qiyaasta nasashada ee xannibaadda ayaa loo dejiyay inay run noqoto haddii horudhacyo aad u yar la helo.Awoodda ionic ee ugu yar ee horreeyaha ayaa lagu dejiyay 5.0e3 iyo qiimaha hore ee ilaa +8 ayaa lagu soo daray tijaabooyinka.
Waqtiga wareegga u dhexeeya baarista waaweyn ee qaabka isku xirka xogta waxaa lagu dejiyay 2.5 ilbiriqsi.Ka saarida tirada badan ee firfircoon ayaa lagu dejiyay 20 s ka dib kala qaybsanaanta koowaad ee ion horudhac ah.Daaqadda go'doominta horudhac ayaa loo dejiyay 2 Th.Nooca tamarta isku dhaca caadiga ah ee leh habka tamarta isku dhaca go'an ayaa lagu doortay iskaanka MS/MS ku tiirsan xogta.Tamarta isku dhaca ayaa lagu dejiyay 30%.Xalka Orbitrap waxaa loo dejiyay 15,000 halka AGC bartilmaameedkeedu yahay 100%.Waqtiga ugu badan ee duritaanka caadada ayaa lagu dejiyay 60 millise seconds.
Kahor intaanan la socon shabakada borotiinka-protein ee muunado isku dhafan, waxaan ku farsameynay faylasha ceeriin anagoo adeegsanayna xirmada MaxQuant (nooca 1.6.12.0) 26,27 si aan u aqoonsano peptides/proteins la raadraaco shaybaarada.Intaa waxaa dheer, falanqaynta borotiinka ee la midka ah ayaa lagu sameeyay muunado Flo-1 aan la isku gudbin oo lagu daaweeyay oo aan lagu daawayn IFNα.Xogta MS/MS waxaa laga dhex baadhay UniProt xogta aadanaha (www.uniprot.org) (la soo galiyay Agoosto 12, 2020, ka kooban 75,093 gelis) iyadoo la adeegsanayo mashiinka raadinta Andromeda27.Baadhitaanka ayaa la sameeyay iyada oo aan la tilmaamin gaar ahaan enzyme-ka iyo isbeddellada kala duwan ee deamidation (N, Q) iyo oxidation (M).Dulqaadyada tirada badan ee horudhaca ah ayaa lagu dejiyay 20 ppm iyo ion alaabta 0.02 Da.weecasho hore iyo ugu badnaan waxaa lagu dejiyay 10 ppm.Tirada ugu badan ee peptide-ka ayaa lagu dejiyay 4600 Da isku xigxiga isku ekaanshaha waxaa la dejiyay inta u dhaxaysa 7 iyo 25 amino acids (aa).Falanqaynta tirakoobka dheeraadka ah ayaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo barnaamijka Perseus (nooca 1.6.10.45).Maaddada borotiinka waxaa lagu xisaabiyay iyadoo caadi loo yeelayo xoogga muuqaalka borotiinka (xoojinta LFQ; tirooyinka aan la calaamadayn)27 iyo qiimaha xoojinta ayaa loo beddelay Log2.Isku dhafka kala sareynta ee borotiinada lagu aqoonsaday xoojinta peptide-kooda ayaa la dhisay iyadoo la adeegsanayo xirmada pheatmap (v1.0.12) ee R (v 4.1.2).Falanqaynta kobcinta dariiqa waxa la sameeyay iyada oo la isticmaalayo xogta dariiqa Reactome ee borotiinada la daaweeyay IFNa kuwaas oo in ka badan afar jeer la hawlgeliyay marka loo eego muunado aan la daawayn.
Aqoonsiga lysine (K) ama serine (S) kiimikaad gaar ah oo isku xidhka isku xidhka borotiinka ee ay kormeerto LC-MS/MS ayaa lagu sameeyay iyada oo la adeegsanayo mashiinka aqoonsiga spectroscopic (SIM-XL) ee peptides-ka-xiran (SIM-XL)29.Marka hore, isdhexgalka suurtagalka ah ee u dhexeeya interferon-laxiriira (IFN) hiddo-wadaha DNA-da ee waxyeelada leh (IRDS) ayaa la baaray iyadoo la adeegsanayo xogta borotiinka IRDS ee lagu sharraxay Padariya et al.28.Baadhitaanka dhammaan xaaladaha iyo ku celcelinta guud ahaan UniProt bini'aadamku waa xisaabin xoog leh, markaa dhammaan xogta UniProt ee bini'aadamka (www.uniprot.org) (la soo dejiyay 12 Agoosto 2020, waxay ka kooban tahay 75,093 gelis) oo liddi ku ah ku celcelinta IFNa-daaweeyay.Mid ka mid ah filtarrada isdhexgalka kalsoonida sare.Isdhexgalkan muhiimka ah ee la helay ayaa la ballaariyay oo lagu tijaabiyay dhammaan ku celcelinta iyo xaaladaha.
SIM-XL, DSS waxaa loo isticmaalay isdhaafsiga (XL) iyo isbeddelka miisaanka XL iyo isbeddelka miisaanka ayaa loo dejiyay 138.06 iyo 156.07, siday u kala horreeyaan.Goobaha soo socda ee falcelinta isdhaafsiga ayaa la tixgaliyaa: KK, KS iyo KN-TERM, iyada oo aan lahayn ion wariyeyaal.Hordhac iyo jajab ppm labadaba waxaa loo dejiyay 20 halka xadka Xrea lagu dejiyay 0.15.Trypsin waxaa loo tixgeliyey in ay tahay mid gebi ahaanba gaar ah, waxaana la hirgeliyey habka kala qaybinta tamarta sare ee C-trap (HCD).Xaddiga dhimista firfircoonida XCorr DB iyo tirada ugu yar ee peptides dhimista firfircoonida DB ayaa loo dejiyay 2.5 iyo 2, siday u kala horreeyaan.Halbeegyada kale waa: ixtimaalka monoisotope iyo gooynta ugu sarraysa ee shilka, ugu yaraan 4 AA haraag kasta iyo kharashka ugu badan ee xadhigga, iyo 3 ugu badnaan ee kala qaybsanaanta seegtay.Natiijadii khariidadaha 2D ee tolnaa ayaa lagu lafa guray (SIM-XL) iyo xQuest28 matalaad garaafeed ayaa loo adeegsaday dhisidda khariidadaha 2D.Isku xirka borotiinka ee qaab dhismeedka borotiinka waxaa lagu bixiyaa PyMol (Nidaamka Sawirka Molecular ee PyMOL, nooca 2.0 Schrödinger, LLC).
Qaab-dhismeedka moodeelka borotiinka ayaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo server-ka Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 iyadoo la adeegsanayo mabaadi'da qaabaynta homology iyo hirgelinta "Habka Markov Qarsoon".Phyre2 waxay abuurtaa qaab dhismeedyo ku salaysan isku xigxiga oo la socda qaab-dhismeedka borotiinka ee la yaqaan.Wixii H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, iyo MDN1 borotiinada, qaab-dhismeedka template 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, iyo 6i2665 ayaa la isticmaalay.Intaa waxaa dheer, qaabka AlphaFold71 MX1, UBP18 iyo ROBO1 ayaa sidoo kale la tixgeliyey.Qaab dhismeedka borotiinka waxaa lagu sawiray iyadoo la adeegsanayo xirmada BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) iyo xirmada Hawlaha Deegaanka Molecular (MOE; Kiimikada Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).